Use of single-enzyme amplified fragment length polymorphism for typing Clostridium perfringens isolated from diarrheic piglets

Clostridium perfringens is an important pathogen in human and veterinary medicine. In swine, the agent is responsible for necrotic enteritis and enterotoxemia characterized by diarrhea, weight loss, delayed development and, in some cases, death. In the present study amplified fragment length polymorphism analyses (AFLP) was used to characterize 54 C. perfringens strains isolated from swine presenting diarrhea. Analysis of the results showed 29 distinct profiles with discriminatory index equal to 0.97. Partial correlation between the origin of the isolates and groups was drawn, and correlation was possible in only 18.5% of the samples. Characterization of the strains in biotypes (A, B, C, D and E), production of beta-2 toxin and enterotoxin were performed by means of the polymerase chain reaction (PCR). Biotypes A, C and D were observed among the strains analyzed. All samples were positive for presence of the gene encoding beta-2 toxin and negative for the gene encoding enterotoxin. AFLP have shown to be a simple, fast, low cost method with high discriminative power and good reproducibility, presenting a great potential in epidemiological studies involving C. perfringens strains of animal origin.

Clostridium perfringens é um importante agente infeccioso em medicina veterinária e humana. Em suínos, o agente é responsável pela enterite necrótica e enterotoxemia, caracterizadas por diarréia, perda de peso, atraso no desenvolvimento e morte. No presente estudo foi utilizado o polimorfismo do comprimento de fragmentos amplificados (AFLP), para caracterizar 54 isolados de C. perfringens obtidos de suínos com diarréia. A análise dos resultados do AFLP demonstrou 29 perfis distintos com índice discriminatório igual a 0,97. A correlação entre a origem dos isolados e os agrupamentos obtidos foi parcial, sendo apenas possível a correlação total de 18,5% das amostras estudadas. A caracterização das cepas em biotipos (A, B, C, D e E), produção da toxina beta-2 e enterotoxina foi realizada através da reação da polimerase em cadeia (PCR). Dentre as cepas analisadas foram observados os biotipos A, C e D, sendo que todas as amostras foram positivas para a presença do gene codificador da toxina beta-2 e negativas para o gene codificador da enterotoxina. Neste estudo, o AFLP demonstrou ser uma metodologia simples, rápida, de baixo custo, com alto poder discriminatório e boa reprodutibilidade, apresentando grande potencial para estudos epidemiológicos envolvendo cepas de C. perfringens de origem animal.

Identification of bacterial agents of enteric diseases by multiplex PCR in growing-finishing pigs

In Brazil, the most common bacterial enteric diseases affecting growing and finishing pigs are porcine proliferative enteritis, porcine intestinal spirochetosis, swine dysentery, and salmonellosis. The diagnosis of these diseases by routine culture techniques is expensive, difficult, time-consuming, and even impossible, in cases of porcine proliferative enteritis. The detection of pathogens by polymerase chain reaction is a highly sensitive and specific method that can be an useful tool in veterinary diagnosis. Two multiplex PCR (M-PCR) assays were tested for simultaneous detection and identification of bacterial agents associated with porcine proliferative enteritis, porcine intestinal spirochetosis, swine dysentery, and salmonellosis in diarrheic fecal samples. The DNA obtained from pure cultures of each bacterial agent or mixed in different combinations and concentrations was amplified by using Lawsonia intracellularis and Salmonella, or Brachyspira pilosicoli and Brachyspira hyodysenteriae specific M-PCR assays. After electrophoresis in agarose gel and staining, the amplification products indicated the presence of individual or simultaneous amplification of L. intracellularis and Salmonella or B. pilosicoli and B. hyodysenteriae specific DNA sequences. After standardization, the M-PCR tests were used to test 541 swine diarrheic fecal samples obtained from different regions in Brazil. The most frequently detected pathogen was Lawsonia intracellularis (13%), followed by Salmonella (4.8%), B. hyodysenteriae (1.4%), B. pilosicoli (1%) and their various associations. Results from this study suggest that the two M-PCR assays can be used for specific detection and identification of four important enteric bacterial pathogens alone or in combination.

A enterite proliferativa suína, a espiroquetose colônica, a disenteria suína e a salmonelose são as doenças entéricas mais freqüentes em suínos das fases de crescimento e terminação no Brasil. O diagnóstico destas doenças através de técnicas bacteriológicas tradicionais é difícil, lento e no caso da enterite proliferativa suína, impossível. A detecção destes agentes através da reação de polimerase em cadeia é altamente sensível e específica e está se tornando uma ferramenta muito útil no diagnóstico em Medicina Veterinária. No presente estudo foram testadas duas técnicas de PCR sob a forma de "multiplex"para detecção e identificação simultânea dos agentes bacterianos envolvidos na enterite proliferativa suína, na espiroquetose colônica, na disenteria suína e na salmonelose em amostras de fezes diarreicas. O DNA obtido de culturas puras de cada agente sozinho ou misturado em diferentes combinações e concentrações foram amplificados utilizando a Multiplex PCR específica para Lawsonia intracellularis e Salmonella, ou Brachispyra pilosicoli e Brachispyra hyodysenteriae. Após a padronização, a M-PCR foi aplicada na detecção dos quatro agentes em 541 amostras de fezes diarreicas de suínos provenientes de diferentes Estados do Brasil. O agente mais freqüente foi Lawsonia intracellularis (13%), seguido pela Salmonella spp. (4,8%), B. hyodysenteriae (1,4%), B. pilosicoli (1%) e suas diferentes associações. Os resultados obtidos indicam que as duas reações testadas permitem a detecção destes quatro importantes patógenos entéricos de maneira rápida e específica.

Efficacy of an inactivated Aujeszky"s disease virus vaccine: experimental infection of pigs / Eficácia de vacina inativada contra a doença de Aujeszky: infecção experimental de suínos

An experimental inactivated, oil assisted Aujeszky"s disease virus vaccine was tested for its ability to induce immunity, clinical protection level and reduction of viral infection after challenge by the nasal route. Groups of 6 pigs, 45 days-old, were vaccinated once or twice, by either intramuscular or subcutaneous routes. A group of unvaccinated animals was used as control. All the vaccinated pigs developed neutralizing antibodies, detected by serum-neutralization test. In pigs vaccinated twice the levels of neutralizing antibodies were higher than in pigs vaccinated once, and this difference was statistically significant. In vaccinated animals, the severity of clinical signs decreased with increasing antibodies titres. Aujeszky"s disease virus was detected in tonsils of vaccinated and unvaccinated pigs by immunofluorescence method. However, the rate of positive tonsils in pigs vaccinated twice was reduced when compared with unvaccinated pigs on the 2nd and 7th days post-infection. The level of infection was statistically reduced in twice vaccinated pigs by subcutaneous route as compared with vaccinated once and unvaccinated animals.

Uma vacina experimental contra a doença de Aujeszky (DA), inativada e adsorvida em adjuvante oleoso, foi testada em relação à indução de imunidade, grau de proteção clínica e capacidade de reduzir a infecção, após desafio pela via intranasal. Grupos de 6 suínos, com 45 dias de idade, foram vacinados com uma ou duas doses de vacina, pelas vias intramuscular ou subcutânea, sendo mantido um grupo-testemunha, sem vacinação. Todos os suínos vacinados apresentaram títulos de anticorpos neutralizantes, detectáveis através da prova de soroneutralização, sendo estatisticamente superiores nos animais que receberam duas doses de vacina. A vacinação preveniu as manifestações clínicas da doença, após desafio, principalmente nos animais que receberam duas doses de vacina quando comparado com os que receberam 1 dose. Em todos os animais, vacinados e não-vacinados, foi possível a detecção do vírus da doença de Aujeszky (VDA) nas amígdalas, através da técnica de imunofluorescência direta. A porcentagem de amígdalas positivas nos suínos vacinados com duas doses foi inferior quando comparada àquela de suínos não-vacinados, no 2º e 7º dias pós-infecção. Em suínos vacinados com duas doses de vacina, pela via subcutânea, a taxa de infecção foi estatisticamente menor que naqueles vacinados com uma dose, pelas vias intramuscular ou subcutânea, e não-vacinados.

Effect of different vehicles in carrageenan suspension on the rate of the inflammatory response of chicks / Efeito de diferentes veículos na suspensão de carragenina sobre a resposta inflamatória em pintos

This paper describes the pattern of edema, increased vascular permeability and cellular exudation elicited by the injection of different carrageenan suspensions into the foot pad of 80 male chicks, three to four-week old. Carrageenan suspensions at 0.5% were prepared in: Ringer Locke solution (RL), glucose aqueous solution 0.1% (G), demineralized water (W) or phosphate buffered saline (PBS). The foot pad volume and vascular permeability were evaluated by pletismography and by Evans blue extravasation, respectively, before and at 0:15, 0:30, 1:00, 1:30, 2:00, 2:30, 3:00, 3:30 and 4:00 hours after injury. Cellular exudation was observed in thin sections of stained tissue 0:30, 1:30, 2:30 and 4:00 hours after injection of the carrageenan or vehicle only. The inflammatory response varied according to the carrageenan suspension used. Suspension C/PBS induced a less intense inflammatory response in foot pads of chicks than C/W, C/G and C/RL suspensions.

Este trabalho descreve o padrão de resposta de edema, aumento de permeabilidade vascular e exsudação celular induzidos pela injeção de diferentes suspensões de carragenina nos coxins plantares de 80 pintos machos, de três a quatro semanas de idade. As suspensões de carragenima 0,5% foram preparadas em: solução de Ringer-Locke (RL), solução aquosa de Glicose (G), água desmineralizada (W) ou tampão fosfato salino (PBS). Antes, e às 0:15, 0:30, 1:00, 1:30, 2:00, 2:30, 3:00, 3:30, e 4:00 horas após a injúria, o volume da pata e a permeabilidade vascular foram avaliados através de pletismografia e extravasamento de Azul de Evans respectivamente. A exsudação celular foi observada em cortes finos de tecido corado, 0:30, 1:30, 2:30 e 4:00 horas após a injeção de carragenina ou somente do veículo. A resposta inflamatória variou de acordo com a suspensão de carragenina utilizada. A suspensão C/PBS induziu uma resposta inflamatória menos intensa nos coxins plantares do que as suspensões de C/W, C/G e C/RL.

Isolation of canine parvovirus in Brazil / Isolamento de parvovirus canino no Brasil

The canine parvovirus was isolated from 24 samples of faeces, one mucosal scraping, one vomiting material obtained from dogs that had presented signs of hemorrhagic enteritis, and from one sample of faeces from a normal dog. All the materials were previously tested by hemagglutination reaction with swine red cells. There is an agreement of 96,3% between this reaction and isolation of parvovirus cell cultures, demonstrating the great practical utility of the hemagglutination reaction as a trial method for the demonstration of the presence of parvovirus in the stool of infected dogs . Electron microscopy of infected cells demonstrated the presence of viral particles with parvovirus morphology and the hemagglutination inhibition and immunofluorescence reactions, using feline parvovirus immune serum, revealed the antigenic relationship between the isolate and feline parvovirus.

Foram examinadas 56 amostras de fezes, 10 de raspada de mucosa intestinal e 2 amostras de material vomitado de cães doentes, além de 7 amostras de fezes de cães normais, com o objetivo de isolar-se o parvovirus canino durante a epizootia de gastroenterite hemorrágica ocorrida em São Paulo. Das 56 amostras de fezes de cães doentes foram isoladas vírus de 24 (42,8%) e das 7 amostras de fezes de cães clinicamente normais foi isolado vírus de apenas 1 (14,3%). Tanto do material vomitado quanto do raspado de mucosa intestinal obteve-se o isolamento de parvovirus de uma amostra apenas, correspondendo a 50% e 10%, respectivamente. A reação de hemaglutinação, realizada com os vários tipos de materiais clínicos, demonstrou concordância de 96,3% com o isolamento de vírus nas 27 amostras positivas, evidenciando a grande utilidade prática desta reação como método de triagem para determinar, nos casos de diarreia em cães, a presença de partículas virais com esta característica hemaglutinante. Em 15 amostras de suspensão fecal e em uma das culturas positivas foi observada, à microscopia eletrônica, a presença de partículas virais com as características morfológicas dos parvovirus. A semelhança antigênica entre o vírus isolado e o parvovirus felino foi demonstrada pela reação de inibição de hemaglutinação e pela imunofluorescência em 5 das amostras isoladas.

Intra-luminal fibrosarcoma in the cranial vena cava of a dog / Fibrossarcoma intra luminal na veia cava cranial de cão

The present study refers to a male animal from the canine species, of indefinite breed, about 12 years old, that for several days had been presenting edema of the head and cervical region, including the former limbs and sternum region. Clinical examination showed high temperature (39,5 C ) bilateral purulent nasal discharge, mixed dyspnea, besides inappetence and prostration. Radiographic examination was impaired by the animal"s condition at the time; other tests performed gave no Information suggesting a circulatory obstruction near the cranial cava. Necropsy revealed a tumor of about 4x2x2 cm located in the luminal cranial cava vein. Histological examination showed it to be a fibrosarcoma.

O relato refere-se a animal da espécie canina, sem raça definida, com aproximadamente 12 anos de idade, que há dias apresentava edema de cabeça, região cervical, atingindo inclusive os membros anteriores e região do esterno. O exame físico mostrava ainda temperatura retal 39,5C, corrimento nasal bilateral purulento, dispneia mista, além de inapetência e prostração. O quadro radiográfico foi prejudicado pelo estado em que o animal se apresentava e os demais exames não forneceram informações que auxiliassem a elucidar o quadro clínico, sugerindo tratar-se de obstrução circulatória na altura da cava cranial. O exame necroscópico mostrou tumoração de aproximadamente 4 x2 x2 cm localizada no lúmen da veia cava cranial que, ao exame histológico, demonstrou tratar-se de fibrossarcoma.

Intra-luminal fibrosarcoma in the cranial vena cava of a dog / Fibrossarcoma intra luminal na veia cava cranial de cão

The present study refers to a male animal from the canine species, of indefinite breed, about 12 years old, that for several days had been presenting edema of the head and cervical region, including the former limbs and sternum region. Clinical examination showed high temperature (39,5 C ) bilateral purulent nasal discharge, mixed dyspnea, besides inappetence and prostration. Radiographic examination was impaired by the animal"s condition at the time; other tests performed gave no Information suggesting a circulatory obstruction near the cranial cava. Necropsy revealed a tumor of about 4x2x2 cm located in the luminal cranial cava vein. Histological examination showed it to be a fibrosarcoma.

O relato refere-se a animal da espécie canina, sem raça definida, com aproximadamente 12 anos de idade, que há dias apresentava edema de cabeça, região cervical, atingindo inclusive os membros anteriores e região do esterno. O exame físico mostrava ainda temperatura retal 39,5C, corrimento nasal bilateral purulento, dispneia mista, além de inapetência e prostração. O quadro radiográfico foi prejudicado pelo estado em que o animal se apresentava e os demais exames não forneceram informações que auxiliassem a elucidar o quadro clínico, sugerindo tratar-se de obstrução circulatória na altura da cava cranial. O exame necroscópico mostrou tumoração de aproximadamente 4 x2 x2 cm localizada no lúmen da veia cava cranial que, ao exame histológico, demonstrou tratar-se de fibrossarcoma.