Avaliação de novos fatores prognósticos em carcinomas vulvares através da integração de dados genômicos e transcriptômicos / Assessment of new prognostic factors in vulvar carcinomas by integrating genomic and transcriptomic data

O carcinoma vulvar é uma neoplasia rara, contudo possui elevada mortalidade (~40%) e pouco se conhece a respeito de sua assinatura molecular. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo identificar genes moduladores dessa neoplasia baseando-se em integração de dados genômicos e transcriptômicos. Para alcançar esse objetivo 17 amostras de carcinomas vulvares que continham DNA e RNA suficientes foram selecionadas para a realização das técnicas de CGH-array e Expressão em larga escala. Os genes obtidos a partir da integração de dados realizada pelo algoritmo CONEXIC foram submetidos a uma avaliação funcional in silico nos softwares IPA e KOBAS e dois genes foram selecionados para a validação por meio de qRT-PCR, absoluta e relativa. A expressão proteica desses genes foi avaliada por IHQ em 150 casos. A avaliação integrada dos dados revelou 47 candidatos a moduladores, dos quais 46 foram classificados com concomitante ganho de cópias e aumento da expressão gênica e somente um com perda de cópia associada à diminuição de expressão. A partir das análises os genes PLXDC2 e GNB3 foram selecionados, sendo o primeiro o único com perda de cópia e diminuição da expressão. A partir da avaliação das variações de intensidade de coloração IHQ entre os tumores foi possível observar que a alta expressão de GNB3 concomitante a menor expressão de PLXDC2 está associada a menor risco de desenvolver metástases linfonodais (p=0,016) e tempos maiores de sobrevida livre de doença (p=0,005). Sendo assim, é possível sugerir que a avaliação proteica desses genes poderia ser usada para avaliação prognóstica.

Vulvar squamous cell carcinoma (VSCC) is a rare disease that has a high mortality rate (~40%). However, little is known about its molecular signature. Therefore, our aims were to identify driver genes in VSCC, based on comparative genome hybridization (aCGH) and genome-wide expression (GWE) array. To achieve that, DNA and RNA were extracted from 17 frozen VSCC samples and examined by aCGH and GWE array, respectively. Based on the integration of data using the CONEXIC algorithm, PLXDC2 and GNB3 were validated by qRT-PCR. The expression of these genes was then analyzed by immunohistochemistry (150 FFPE samples). In our integrative analysis, we identified 47 putative drivers­46 of which were characterized by copy number gains that were concomitant with overexpression and 1 with a copy number loss and downregulation. Two of these genes were selected for further validation: PLXDC2 and GNB3. GNB3 was overexpressed and PLXDC2 was downregulated compared with normal samples. By IHC, both proteins were ubiquitously expressed throughout vulvar tissue. High expression of GNB3 and low PLXDC2 immunostaining in the same sample was linked to less lymph node metastasis (p=0.016) and greater disease-free survival (p=0.005). Based on a robust methodology never used before for VSCC evaluation, this study proposes 2 novel prognostic markers in vulvar cancer. GNB3 is associated with a good prognosis, and PLXDC2 correlates with worse outcomes.

Alterações em genes supressores de tumor em carcinoma de vulva: correlação com fatores prognósticos anátomo-patológicos, dados clínicos, infecção por HPV e expressão de proteínas / Tumor suppressor genes alterations in vulvar carcinoma: correlation with pathological and clinical data, HPV infection and protein expression

Introdução: O carcinoma de vulva é um tumor de baixa ocorrência, sendo responsável por menos de 3% de todas neoplasias femininas. Sua incidência é de 1,8 a 20 para 100.000 mulheres, dependendo da faixa etária de abrangência. Em mulheres jovens a ocorrência da doença esta atrelada a fatores de risco como por tabagismo e infecção por HPV,e em mulheres acima dos 50 anos esse câncer ocorre por mecanismos genéticos ainda pouco elucidados. Objetivo: Identificar alterações em genes supressores de tumor, buscando correlacionar estas alterações com a presença de infecção por HPV para a determinação de valores prognósticos em carcinomas de vulva. Métodos: 139 casos de câncer de vulva foram selecionados dos prontuários do Departamento de Anatomia Patológica do Hospital A. C. Camargo. Foram avaliadas alterações em genes supressores de tumor através de técnicas de IHQ e FISH e qRT-PCR. Resultados: A idade das pacientes incluídas nesse trabalho variou entre 15 e 98 anos com uma mediana de 71 anos. A infecção por HPV estava presente em 41% dos casos. A relação entre a IHQ e as variáveis clinicas e anátomo-patológicas não demonstrou nenhuma relação com a infecção por HPV, e somente p14 demonstrou relação com a sobrevida das pacientes.As reações de FISH demonstraram perda de um ou dois alelos de PTEN e TP53 em 3% e 6,3% dos casos, respectivamente. A avaliação da expressão gênica demonstrou maior expressão nas amostras tumorais quando comparadas às amostras normais para CDKN2A (p14 e p16) e TP73, o contrário foi observado para CDKN1A, TP53 e PTEN. Conclusões: A expressão protéica de p14 representa pior prognóstico para as pacientes acometidas por carcionoma vulvar, enquanto as demais avaliadas não podem ser consideradas para essa finalidade.

Backgroud: Vulvar carcinoma is a tumor of low occurrence, accounting for less than 3% of all female cancers. Its incidence varies from 1.8 to 20 per 100,000 women, depending on the age of coverage. In young women the occurrence of the disease is linked to risk factors such as smoking and infection by HPV, and in women over 50 years the cause of this cancer is poorly understood. Aims: Identify changes in tumor suppressor genes, trying to correlate these changes with the presence of HPV infection to determine prognostic values in vulvar carcinomas. Methods: 139 cases of vulvar carcinomas were selected from the files of the Department of Anatomic Pathology, Hospital A. C. Camargo. We assessed changes in tumor suppressor genes through FISH, IHC and qRT-PCR. Results: The age of the patients included in this study varied between 15 and 98 years with a median of 71 years. HPV infection was present in 41% of cases. The relationship between the IHC and the clinical and anatomic-pathological data showed no relationship to HPV infection, and only p14 correlated with survival of patients. FISH showed a loss of one or both alleles of PTEN and TP53 in 3% and 5.3% of cases, respectively. The evaluation of gene expression showed increased expression in tumor samples compared to normal samples for CDKN2A (p14 and p16) and TP73. The opposite was observed for CDKN1A, TP53 and PTEN. Conclusions: p14 protein expression represents a worse prognosis for patients affected by vulvar carcionoma, while the other evaluated can not be considered for this purpose.