RESUMO
BACKGROUND: Interleukin-12 is an important cytokine in mediating cellular immune responses. RESULTS: Recombinant single-chain canine IL-12 was produced in a baculovirus-insect cell system with the aim of conducting further studies on modulation of immune responses in dogs. To optimize the production of recombinant canine IL-12, a classical baculovirus and a modified vector (chitinase A and v-cathepsin knockout) were used containing a native or an optimized insert of canine IL-12. The optimized IL-12 construct contained the GP64 signal peptide and was synthesized with optimized codons for expression in Trichoplusia ni cells. Dot-blot and Western blot analysis showed the highest production levels of recombinant IL-12 protein by the use of the modified baculovirus vector containing the optimized insert, at a multiplicity of infection of five and at 48 h after infection. The recombinant cytokine was successfully purified and showed a good degree of purity, integrity, folding, and yield, with very little endotoxin contamination. Recombinant canine IL-12 induced IFN-γ in canine lymphocytes, indicating that it was biologically active. CONCLUSION: Therefore, this study describes an efficient method to produce adequate amounts of biologically active canine IL-12, useful for immunomodulation studies in dogs.
Assuntos
Baculoviridae/genética , Engenharia Genética/métodos , Vetores Genéticos/metabolismo , Interleucina-12/biossíntese , Animais , Baculoviridae/metabolismo , Catepsinas/genética , Catepsinas/metabolismo , Linhagem Celular , Quitinases/genética , Quitinases/metabolismo , Clonagem Molecular , Cães , Expressão Gênica , Vetores Genéticos/química , Interleucina-12/genética , Interleucina-12/farmacologia , Linfócitos/citologia , Linfócitos/efeitos dos fármacos , Linfócitos/metabolismo , Mariposas , Cultura Primária de Células , Dobramento de Proteína , Sinais Direcionadores de Proteínas , Proteínas Recombinantes/biossíntese , Proteínas Recombinantes/genética , Proteínas Recombinantes/farmacologia , Células Sf9 , SpodopteraRESUMO
BACKGROUND: Very few studies have been carried out so far aiming at modulating cellular immune responses in dogs. In this study, we evaluated the ability of recombinant canine IL-2 (rcaIL-2) and IL-12, in the form of a single-chain fusion protein (rsccaIL-12), to stimulate peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy mongrel dogs. RESULTS: Recombinant canine IL-2 purified from Escherichia coli or present in the supernatant of COS-7 cells transfected with pcDNA3.1-caIL-2 (COS-7 caIL-2 supernatant) was able to induce proliferation of CTLL-2 cells, thus showing their functional activity. In addition, purified rcaIL-2 and COS-7 caIL-2 supernatant stimulated resting canine PBMC proliferation to a level higher than baseline level. Neither COS-7 sccaIL-12 supernatant nor COS-7 caIL-2 supernatant alone was able to induce significant production of interferon gamma by resting PBMC. However, COS-7 sccaIL-12 supernatant in combination with COS-7 caIL-2 supernatant induced production of IFN-γ by those cells. CONCLUSIONS: The data shown herein suggest that the combination of canine recombinant IL-12 and IL-2 can be useful to promote cellular immune responses in dogs.
Assuntos
Interleucina-12/farmacologia , Interleucina-2/farmacologia , Leucócitos Mononucleares/efeitos dos fármacos , Proteínas Recombinantes de Fusão/farmacologia , Animais , Células COS , Chlorocebus aethiops , Cães , Sinergismo Farmacológico , Escherichia coli/genética , Escherichia coli/metabolismo , Feminino , Expressão Gênica , Interferon gama/biossíntese , Interferon gama/metabolismo , Interleucina-12/biossíntese , Interleucina-12/genética , Interleucina-2/biossíntese , Interleucina-2/genética , Leucócitos Mononucleares/citologia , Leucócitos Mononucleares/imunologia , Ativação Linfocitária/efeitos dos fármacos , Masculino , Cultura Primária de Células , Proteínas Recombinantes de Fusão/biossíntese , Proteínas Recombinantes de Fusão/genéticaRESUMO
Leishmaniose visceral zoonótica (LV) é uma doença que afeta homens e cães e é causada por protozoários das espécies Leishmania infantum e Leishmania chagasi. O cão doméstico é o principal reservatório do agente causal. Uma vacina efetiva contra a LV canina poderá contribuir para o controle da infecção e/ou doença humana e canina. A resposta imune protetora contra a LV canina é do tipo celular (Th1). Em nosso laboratório, dentre um grupo de cinco antígenos ecombinantes selecionados de uma biblioteca de cDNA de L. chagasi, usando-se uma mistura de soro de cães naturalmente infectados e que exibiam resposta imune humoral e celular específica, um fragmento da extremidade carboxila de uma cinesina com cauda de 6 histidinas (rLci2B-NH6), para permitir a purificação, foi escolhido para a avaliação do seu potencial como candidato a componente de uma vacina contra LV canina. No presente trabalho foi avaliada a imunização de camundongos BALB/c com rLci2BNH6/ saponina em associação com os plasmídeos pcDNA3.1-scmu-IL-12 e/ou pcDNA3.1-mu-IL-2. Os animais imunizados com rLci2B-NH6/saponina em associação com a IL-12 e/ou IL-2 produziram anticorpos IgG, IgG2a e IgG1 específicos. Esplenócitos desses animais exibiram proliferação, mas não produziram IFN-γ ou IL-5 após estimulação in vitro com rLci2B-NH6. Esses resultados sugerem que a adição de pcDNA3.1-mu-IL-2 no protocolo de imunização não é capaz de promover uma resposta imune predominantemente Th1. Também foi avaliada a imunização de camundongos com proteína recombinante quimérica (rLci2-NTCT-NH6) formada pelos domínios não repetitivos presentes nas extremidades amina e carboxila codificadas pelo gene da cinesina. Camundongos BALB/c imunizados com rLci2- NT-CT-NH6 ou uma proteína recombinante químerica controle, contendo 5 domínios repetitivos presentes em rLci2B-NH6 entre os domínios não repetitivos de rLci2-NT-CTNH6, apresentaram produção de IgG, IgG2a e IgG1. Esplenócitos desses animais exibiram proliferação, mas não produziram IFN-γ e apenas esplenócitos dos camundongos imunizados com rLci2-NT-5R-CT-NH6 sintetizaram IL-5, após estimulação in vitro com as respectivas proteínas. Contudo, durante a purificação de rLci2-NT-CT-NH6 e rLci2-NT-5R-CT-NH6 ocorreu intensa proteólise que pode ter resultado na destruição de epítopos capazes de induzir resposta Th1. Previamente, em nosso laboratório, foi observada a morte de alguns camundongos injetados com 100 μg saponina/dose, por isso, doses menores de saponina (50 ou 25 μg) foram avaliadas como adjuvante na indução de resposta imune a rLci2B-NH6. Os resultados da mensuração dos anticorpos foram semelhantes nos três grupos. Curiosamente, somente esplenócitos do grupo injetado com 25 μg/dose exibiram proliferação específica. O grupo injetado com 100 μg/dose produziu IFN-γ e IL-5 e o grupo injetado com 50 μg/dose sintetizou IFN-γ, mas não produziu IL-5, após estimulação in vitro com rLci2B-NH6.
