Use of single-enzyme amplified fragment length polymorphism for typing Clostridium perfringens isolated from diarrheic piglets

Clostridium perfringens is an important pathogen in human and veterinary medicine. In swine, the agent is responsible for necrotic enteritis and enterotoxemia characterized by diarrhea, weight loss, delayed development and, in some cases, death. In the present study amplified fragment length polymorphism analyses (AFLP) was used to characterize 54 C. perfringens strains isolated from swine presenting diarrhea. Analysis of the results showed 29 distinct profiles with discriminatory index equal to 0.97. Partial correlation between the origin of the isolates and groups was drawn, and correlation was possible in only 18.5% of the samples. Characterization of the strains in biotypes (A, B, C, D and E), production of beta-2 toxin and enterotoxin were performed by means of the polymerase chain reaction (PCR). Biotypes A, C and D were observed among the strains analyzed. All samples were positive for presence of the gene encoding beta-2 toxin and negative for the gene encoding enterotoxin. AFLP have shown to be a simple, fast, low cost method with high discriminative power and good reproducibility, presenting a great potential in epidemiological studies involving C. perfringens strains of animal origin.

Clostridium perfringens é um importante agente infeccioso em medicina veterinária e humana. Em suínos, o agente é responsável pela enterite necrótica e enterotoxemia, caracterizadas por diarréia, perda de peso, atraso no desenvolvimento e morte. No presente estudo foi utilizado o polimorfismo do comprimento de fragmentos amplificados (AFLP), para caracterizar 54 isolados de C. perfringens obtidos de suínos com diarréia. A análise dos resultados do AFLP demonstrou 29 perfis distintos com índice discriminatório igual a 0,97. A correlação entre a origem dos isolados e os agrupamentos obtidos foi parcial, sendo apenas possível a correlação total de 18,5% das amostras estudadas. A caracterização das cepas em biotipos (A, B, C, D e E), produção da toxina beta-2 e enterotoxina foi realizada através da reação da polimerase em cadeia (PCR). Dentre as cepas analisadas foram observados os biotipos A, C e D, sendo que todas as amostras foram positivas para a presença do gene codificador da toxina beta-2 e negativas para o gene codificador da enterotoxina. Neste estudo, o AFLP demonstrou ser uma metodologia simples, rápida, de baixo custo, com alto poder discriminatório e boa reprodutibilidade, apresentando grande potencial para estudos epidemiológicos envolvendo cepas de C. perfringens de origem animal.

Identification of bacterial agents of enteric diseases by multiplex PCR in growing-finishing pigs

In Brazil, the most common bacterial enteric diseases affecting growing and finishing pigs are porcine proliferative enteritis, porcine intestinal spirochetosis, swine dysentery, and salmonellosis. The diagnosis of these diseases by routine culture techniques is expensive, difficult, time-consuming, and even impossible, in cases of porcine proliferative enteritis. The detection of pathogens by polymerase chain reaction is a highly sensitive and specific method that can be an useful tool in veterinary diagnosis. Two multiplex PCR (M-PCR) assays were tested for simultaneous detection and identification of bacterial agents associated with porcine proliferative enteritis, porcine intestinal spirochetosis, swine dysentery, and salmonellosis in diarrheic fecal samples. The DNA obtained from pure cultures of each bacterial agent or mixed in different combinations and concentrations was amplified by using Lawsonia intracellularis and Salmonella, or Brachyspira pilosicoli and Brachyspira hyodysenteriae specific M-PCR assays. After electrophoresis in agarose gel and staining, the amplification products indicated the presence of individual or simultaneous amplification of L. intracellularis and Salmonella or B. pilosicoli and B. hyodysenteriae specific DNA sequences. After standardization, the M-PCR tests were used to test 541 swine diarrheic fecal samples obtained from different regions in Brazil. The most frequently detected pathogen was Lawsonia intracellularis (13%), followed by Salmonella (4.8%), B. hyodysenteriae (1.4%), B. pilosicoli (1%) and their various associations. Results from this study suggest that the two M-PCR assays can be used for specific detection and identification of four important enteric bacterial pathogens alone or in combination.

A enterite proliferativa suína, a espiroquetose colônica, a disenteria suína e a salmonelose são as doenças entéricas mais freqüentes em suínos das fases de crescimento e terminação no Brasil. O diagnóstico destas doenças através de técnicas bacteriológicas tradicionais é difícil, lento e no caso da enterite proliferativa suína, impossível. A detecção destes agentes através da reação de polimerase em cadeia é altamente sensível e específica e está se tornando uma ferramenta muito útil no diagnóstico em Medicina Veterinária. No presente estudo foram testadas duas técnicas de PCR sob a forma de "multiplex"para detecção e identificação simultânea dos agentes bacterianos envolvidos na enterite proliferativa suína, na espiroquetose colônica, na disenteria suína e na salmonelose em amostras de fezes diarreicas. O DNA obtido de culturas puras de cada agente sozinho ou misturado em diferentes combinações e concentrações foram amplificados utilizando a Multiplex PCR específica para Lawsonia intracellularis e Salmonella, ou Brachispyra pilosicoli e Brachispyra hyodysenteriae. Após a padronização, a M-PCR foi aplicada na detecção dos quatro agentes em 541 amostras de fezes diarreicas de suínos provenientes de diferentes Estados do Brasil. O agente mais freqüente foi Lawsonia intracellularis (13%), seguido pela Salmonella spp. (4,8%), B. hyodysenteriae (1,4%), B. pilosicoli (1%) e suas diferentes associações. Os resultados obtidos indicam que as duas reações testadas permitem a detecção destes quatro importantes patógenos entéricos de maneira rápida e específica.