RESUMO
Macrophages (MØ) are cells with high plasticity that can be reprogrammed into two distinct phenotypes – MØ M1 (pro-inflammatory) and MØ M2 (pro-resolving) – according to the nature of the disorder detected in the organism. Experimentally, it is already possible to induce the reprogramming of macrophages to M1 and M2 and the functional and metabolic status of both phenotypes have already been characterized. Previous studies by our group have shown that Crotoxin (CTX) exerts two actions on macrophages that make them suitable in cell therapy: 1) it alters their metabolic and functional profile and 2) these effects are long-lasting. Such effects are observed after a single, short exposure to the toxin. In this context, this research sought to characterize the metabolism and functional status of MØ treated with different concentrations of CTX, with the aim of verifying whether in each concentration it is possible to identify different phenotypes and activation states of the already identified M1 and M2 profiles, in order to seek to reprogram these cells according to specific pathophysiological processes. The capacity for phenotypic reprogramming of monocytes induced by CTX was evaluated in in vitro assays, using cells of the human monocytic lineage (THP-1), previously incubated with RPMI medium (control), or LPS (1ug/mL) or tumor conditioned medium of MCF7 cells (MCT) for 48 hours. Subsequently, they were incubated in the absence (control) or presence of CTX at different concentrations (2 nM; 10 nM; 50 nM and 100 nM) for 1 hour. After the different incubation protocols with the toxin, the differentiation and phenotype markers were analyzed using the qPCR technique, and the latter were also analyzed using flow cytometry. To evaluate the effects of treatments on cellular functions, the phagocytosis capacity, the generation of reactive oxygen species (H2O2) and the production of cytokines by MØ were observed. Cellular metabolism was evaluated through gene expression and activity of key enzymes of the glycolytic pathway. The data presented show that THP-1 cells are satisfactorily differentiated by LPS (1 µg/mL) and tumor environment-MCT (vol. obtained from 1x106 /mL) and these cells have their functions modulated distinctly by CTX, depending on the concentration used. CTX had a dual action on the functions of these human macrophages, since it induced phagocytosis activity, while at the same time stimulated the production of H2O2 in control cells. However, these effects vary depending on the microenvironment stimuli, since, in a tumor and inflammatory context, phagocytosis was preserved in a concentration-dependent manner, concomitant with the increase in H2O2 release in some concentrations. Regarding the metabolic pathways, the undifferentiated THP-1 cells did not show alteration in the gene expression of any of the evaluated glycolytic enzymes, under the effect of any concentration of CTX, suggesting that the toxin does not modulate the expression of these enzymes in the THP-1 cell in monocyte condition. However, when stimulated by LPS and MCT, CTX modulated the gene expression of some enzymes: the 50 nM concentration increased the expression of enzymes from metabolic pathways that are more active in M1 (PFK, FAS and citrate synthase) and also reduced the activity of the enzyme CPT-1 (lipolysis), wich hight activity is related to M2. These effects were accompanied by an increase in pro-inflammatory cytokines. In the inflammatory environment (LPS) the concentration of 10 nM of the toxin promoted a concomitant positive marking of both M1 and M2 markers. Also, at 100 nM CTX promoted parallel release of pro- and anti-inflammatory cytokines. Taken together, the results allow us to state that CTX modulates functions and bioenergetic pathways of human macrophages, depending on the concentration used and the microenvironment stimulus involved.
Os macrófagos (MØ) são células com alta plasticidade que podem ser reprogramados em dois fenótipos distintos – MØ M1 (pró-inflamatórios) e MØ M2 (pró-resolutivos) – de acordo com a natureza do distúrbio detectado no organismo. Experimentalmente, já é possível induzir a reprogramação de macrófagos a M1 e M2 e o estado funcional e metabólico de ambos os fenótipos já foram caracterizados. Estudos prévios de nosso grupo demostraram que a Crotoxina (CTX) exerce em macrófagos duas ações que os tornam aplicáveis em terapia celular: 1) altera seu perfil metabólico e funcional e 2) estes efeitos são de longa duração. Tais efeitos são observados após uma única e curta exposição à toxina. Neste contexto, esta pesquisa buscou caracterizar o metabolismo e o estado funcional de MØ tratados com diferentes concentrações de CTX, com o objetivo de verificar se em cada concentração é possível identificar fenótipos distintos e intermediários aos perfis M1 e M2 já descritos, para assim buscar reprogramar essas células de acordo com processos fisiopatológicos específicos. A capacidade de reprogramação fenotípica de monócitos induzida pela CTX foi avaliada em ensaios in vitro, utilizando células da linhagem monocítica humana (THP-1), incubadas previamente com meio RPMI (controle), ou LPS (1ug/mL) ou meio condicionado tumoral de MCF-7 (MCT) por 48 horas. Posteriormente, elas foram incubadas na ausência (controle) ou presença de CTX em diferentes concentrações (2 nM; 10 nM; 50 nM e 100 nM) ao longo de 1 hora. Após os diferentes protocolos de incubação com a toxina foram analisados os marcadores de diferenciação e de fenótipos, por meio da técnica de qPCR, sendo que os últimos também foram analisados por meio de citometria de fluxo. Para avaliar os efeitos dos tratamentos sobre as funções celulares, foram analisadas a capacidade de fagocitose, a geração de espécies reativas de oxigênio (H2O2) e a produção de citocinas pelos MØ. O metabolismo celular foi avaliado por meio da expressão gênica e atividade das enzimas chave da via glicolítica. Os dados apresentados evidenciam que células THP-1 são satisfatoriamente diferenciadas por LPS (1 µg/mL) e meio condicionado tumoral-MCT (Vol. obtido de 1x106 /mL) e essas células têm suas funções moduladas distintamente pela CTX, a depender da concentração utilizada. A CTX acarretou ação dual sobre as funções destes macrófagos humanos, uma vez que induziu inibição da atividade de fagocitose, ao mesmo tempo que estimulou a produção de H2O2 em células controle. Porém, esses efeitos mudam dependendo dos estímulos do microambiente, já que, em contexto tumoral e inflamatório a fagocitose foi preservada de modo concentração-dependente, acompanhada do aumento da liberação de H2O2 em algumas concentrações. Em relação às vias metabólicas, as células THP-1 não diferenciadas não apresentaram alteração na expressão gênica de nenhuma das enzimas glicolíticas avaliadas, sob o efeito de quaisquer concentrações da CTX, sugerindo que a toxina não modula a expressão dessas enzimas na célula THP-1 na condição de monócito. Porém, quando estimuladas por LPS e MCT a CTX modulou a expressão gênica de algumas enzimas: a concentração de 50 nM aumentou a expressão de enzimas de vias metabólicas que estão mais ativas em M1 (PFK, FAS e citrato sintase) e ainda reduziu a atividade da enzima CPT-1 (lipólise), cuja alta atividade está relacionada ao perfil M2. Estes efeitos foram acompanhados do aumento de citocinas pró-inflamatórias. No ambiente inflamatório (LPS) a concentração de 10 nM da toxina promoveu a marcação positiva concomitante de marcadores tanto de M1 quanto de M2. Já em 100 nM a CTX promoveu liberação paralela de citocinas pró- e anti-inflamatórias. Reunidos, os resultados nos permitem afirmar que a CTX modula funções e as vias bioenergéticas de macrófagos humanos, dependendo da concentração utilizada e do estímulo de microambiente envolvido.