RESUMO
Using X-ray crystallography, we have directly observed the path of mRNA in the 70S ribosome in Fourier difference maps at 7 A resolution. About 30 nucleotides of the mRNA are wrapped in a groove that encircles the neck of the 30S subunit. The Shine-Dalgarno helix is bound in a large cleft between the head and the back of the platform. At the interface, only about eight nucleotides (-1 to +7), centered on the junction between the A and P codons, are exposed, and bond almost exclusively to 16S rRNA. The mRNA enters the ribosome around position +13 to +15, the location of downstream pseudoknots that stimulate -1 translational frame shifting.
Assuntos
Conformação de Ácido Nucleico , RNA Mensageiro/química , RNA Mensageiro/metabolismo , Ribossomos/química , Ribossomos/metabolismo , Bacteriófago T4/genética , Pareamento de Bases , Sequência de Bases , Sítios de Ligação , Códon/genética , Cristalografia por Raios X , Proteínas de Ligação a DNA/genética , Escherichia coli/genética , Análise de Fourier , Mudança da Fase de Leitura do Gene Ribossômico , Modelos Moleculares , Dados de Sequência Molecular , Ligação Proteica , Conformação Proteica , Subunidades Proteicas , RNA Mensageiro/genética , RNA Ribossômico 16S/química , RNA Ribossômico 16S/genética , RNA Ribossômico 16S/metabolismo , Ribossomos/genética , Thermus thermophilus/química , Proteínas Virais/genéticaRESUMO
We describe the crystal structure of the complete Thermus thermophilus 70S ribosome containing bound messenger RNA and transfer RNAs (tRNAs) at 5.5 angstrom resolution. All of the 16S, 23S, and 5S ribosomal RNA (rRNA) chains, the A-, P-, and E-site tRNAs, and most of the ribosomal proteins can be fitted to the electron density map. The core of the interface between the 30S small subunit and the 50S large subunit, where the tRNA substrates are bound, is dominated by RNA, with proteins located mainly at the periphery, consistent with ribosomal function being based on rRNA. In each of the three tRNA binding sites, the ribosome contacts all of the major elements of tRNA, providing an explanation for the conservation of tRNA structure. The tRNAs are closely juxtaposed with the intersubunit bridges, in a way that suggests coupling of the 20 to 50 angstrom movements associated with tRNA translocation with intersubunit movement.
Assuntos
RNA Mensageiro/química , RNA Ribossômico/química , RNA de Transferência Aminoácido-Específico/química , RNA de Transferência/química , Proteínas Ribossômicas/química , Ribossomos/química , Ribossomos/ultraestrutura , Anticódon , Proteínas de Bactérias/química , Proteínas de Bactérias/metabolismo , Sequência de Bases , Sítios de Ligação , Cristalografia por Raios X , Modelos Moleculares , Dados de Sequência Molecular , Conformação de Ácido Nucleico , Biossíntese de Proteínas , Conformação Proteica , RNA Bacteriano/química , RNA Bacteriano/metabolismo , RNA Mensageiro/metabolismo , RNA Ribossômico/metabolismo , RNA de Transferência/metabolismo , RNA de Transferência Aminoácido-Específico/metabolismo , Proteínas Ribossômicas/metabolismo , Ribossomos/metabolismo , Thermus thermophilus/química , Thermus thermophilus/ultraestruturaAssuntos
Ligantes , Ribossomos/ultraestrutura , Sítios de Ligação , Conformação de Ácido Nucleico , Conformação Proteica , RNA Mensageiro/química , RNA Mensageiro/metabolismo , RNA Ribossômico/química , RNA Ribossômico/ultraestrutura , RNA de Transferência/química , RNA de Transferência/metabolismo , Proteínas Ribossômicas/química , Sensibilidade e Especificidade , Thermus thermophilusRESUMO
Ribosomal protein S8, which is essential for the assembly of the central domain of 16S rRNA, is one of the most thoroughly studied RNA-binding proteins. To map its surrounding RNA in the ribosome, we carried out directed hydroxyl radical probing of 16S rRNA using Fe(II) tethered to nine different positions on the surface of protein S8 in 70S ribosomes. Hydroxyl radical-induced cleavage was observed near the classical S8-binding site in the 620 stem, and flanking the other S8-footprinted regions of the central domain at the three-helix junction near position 650 and the 825 and 860 stems. In addition, cleavage near the 5' terminus of 16S rRNA, in the 300 region of its 5' domain, and in the 1070 region of its 3'-major domain provide information about the proximity to S8 of RNA elements not directly involved in its binding. These data, along with previous footprinting and crosslinking results, allowed positioning of protein S8 and its surrounding RNA elements in a 7.8-A map of the Thermus thermophilus 70S ribosome. The resulting model is in close agreement with the extensive body of data from previous studies using protein-protein and protein-RNA crosslinking, chemical and enzymatic footprinting, and genetics.
Assuntos
RNA Ribossômico 16S/química , Proteínas Ribossômicas/química , Ribossomos/química , Proteínas de Bactérias/química , Proteínas de Bactérias/genética , Proteínas de Bactérias/metabolismo , Cristalografia por Raios X , Radical Hidroxila/química , Modelos Moleculares , Mutagênese Sítio-Dirigida , Conformação de Ácido Nucleico , Conformação Proteica , RNA Bacteriano/química , RNA Bacteriano/metabolismo , RNA Ribossômico 16S/metabolismo , Proteínas Ribossômicas/genética , Proteínas Ribossômicas/metabolismo , Ribossomos/metabolismo , Eletricidade Estática , Thermus thermophilus/genética , Thermus thermophilus/metabolismoRESUMO
Structures of 70S ribosome complexes containing messenger RNA and transfer RNA (tRNA), or tRNA analogs, have been solved by x-ray crystallography at up to 7.8 angstrom resolution. Many details of the interactions between tRNA and the ribosome, and of the packing arrangements of ribosomal RNA (rRNA) helices in and between the ribosomal subunits, can be seen. Numerous contacts are made between the 30S subunit and the P-tRNA anticodon stem-loop; in contrast, the anticodon region of A-tRNA is much more exposed. A complex network of molecular interactions suggestive of a functional relay is centered around the long penultimate stem of 16S rRNA at the subunit interface, including interactions involving the "switch" helix and decoding site of 16S rRNA, and RNA bridges from the 50S subunit.
Assuntos
RNA Ribossômico/química , RNA de Transferência/química , Ribossomos/química , Ribossomos/fisiologia , Thermus thermophilus/química , Anticódon/metabolismo , Proteínas de Bactérias/química , Proteínas de Bactérias/metabolismo , Pareamento de Bases , Sítios de Ligação , Cristalização , Cristalografia por Raios X , Análise de Fourier , Modelos Moleculares , Conformação de Ácido Nucleico , Fatores de Alongamento de Peptídeos/metabolismo , Biossíntese de Proteínas , Conformação Proteica , RNA Bacteriano/química , RNA Bacteriano/metabolismo , RNA Mensageiro/química , RNA Mensageiro/metabolismo , RNA Ribossômico/metabolismo , RNA Ribossômico 16S/química , RNA Ribossômico 23S/química , RNA de Transferência/metabolismo , Proteínas Ribossômicas/química , Proteínas Ribossômicas/metabolismo , Ribossomos/ultraestrutura , Thermus thermophilus/ultraestruturaRESUMO
The 7.8 angstrom crystal structure of the 70S ribosome reveals a discrete double-helical bridge (B4) that projects from the 50S subunit, making contact with the 30S subunit. Preliminary modeling studies localized its contact site, near the bottom of the platform, to the binding site for ribosomal protein S15. Directed hydroxyl radical probing from iron(II) tethered to S15 specifically cleaved nucleotides in the 715 loop of domain II of 23S ribosomal RNA, one of the known sites in 23S ribosomal RNA that are footprinted by the 30S subunit. Reconstitution studies show that protection of the 715 loop, but none of the other 30S-dependent protections, is correlated with the presence of S15 in the 30S subunit. The 715 loop is specifically protected by binding free S15 to 50S subunits. Moreover, the previously determined structure of a homologous stem-loop from U2 small nuclear RNA fits closely to the electron density of the bridge.
Assuntos
RNA Bacteriano/química , RNA Ribossômico 23S/química , Proteínas Ribossômicas/metabolismo , Ribossomos/química , Proteínas de Bactérias/química , Proteínas de Bactérias/metabolismo , Sítios de Ligação , Cristalografia por Raios X , Escherichia coli/química , Radical Hidroxila , Conformação de Ácido Nucleico , Conformação Proteica , RNA Bacteriano/metabolismo , RNA Ribossômico 23S/metabolismo , RNA Nuclear Pequeno/química , RNA Nuclear Pequeno/metabolismo , Proteínas Ribossômicas/química , Ribossomos/metabolismo , Ribossomos/ultraestrutura , Thermus thermophilus/químicaAssuntos
Escherichia coli/metabolismo , Biossíntese Peptídica , Peptídeos , Biossíntese de Proteínas , Aminoacil-RNA de Transferência/metabolismo , Ribossomos/metabolismo , Aminoácidos/metabolismo , Radioisótopos de Carbono , Indicadores e Reagentes , Cinética , Polilisina/biossíntese , Técnica de Diluição de Radioisótopos , Moldes GenéticosRESUMO
Misacylated phenylalanyl-tRNALys, just as lysyl-tRNALys, but not phenylalanyl-tRNAPhe, have been shown to serve as substrates for ribosomal synthesis of polypeptides (polyphenylalanine and polylysine, respectively) in the absence of a template polynucleotide (poly(A)). The conclusion was made that it is the structure of tRNA that determines the ability of the aminoacyl-tRNALys to participate in peptide elongation on ribosomes without codon-anticodon interactions.
