Chemical and physical methods of triploidy induction in Crassostrea gigas (Thunberg, 1793) / Métodos químico e físico de indução à triploidia em Crassostrea gigas (Thunberg, 1793)

Three methods of triploidy (3N) induction were tested in diploid (2N) oysters Crassostrea gigas: two chemical methods cytochalasin-B (CB) and 6-dimethylaminopurine (6-DMAP), and one physical method with temperature shock. The objective was to evaluate the triploidy induction technology using flow cytometry as a tool to check the results of induction. The experiments were performed in separate and a seawater temperature in the tanks was maintained at 25 C for all experiments. In the experiment I, the efficacy of triploidy induction was evaluated using CB (0.5 mg L-1) and 6-DMAP (390 mols L-1). In the experiment II, the efficiency of triploidy induction was tested using CB (0.5 mg L-1) and 6-DMAP (450 mols L-1). In the experiment III, the efficiency of triploidy induction was evaluated using CB (0.5 mg L-1) and temperature shock (25 to 36 C). In all three experiments, viable triploid larvae were obtained. However, in the experiments I and II (with chemical methods), high mortality of larvae was observed, especially for the treatment CB. From these results, it is suggested the replacement of CB by other methods of triploidy induction, due to its high cost and high toxicity to humans and to the environment.

Três métodos de indução à triploidia (3N) foram testados em ostras diplóides (2N) (Crassostrea gigas); dois métodos químicos, citocalasina-B (CB) e 6-dimetilaminopurina (6-DMAP), e um método físico, com choque de temperatura. O objetivo foi avaliar a tecnologia de indução à triploidia, utilizando a técnica de citometria de fluxo como ferramenta para verificação dos resultados de indução. Os experimentos foram realizados em separado, sendo que a temperatura da água do mar foi mantida em 25 C em todos os tanques. No experimento I, foi avaliada a eficácia da indução à triploidia com CB (0,5 mg L-1) e 6-DMAP (390 mols L-1). No experimento II, foi testada a eficiência da indução à triploidia com CB (0,5 mg L-1) e 6-DMAP (450 mols L-1). No experimento III, foi avaliada a eficiência da indução à triploidia com CB (0,5 mg L-1) e choque de temperatura (25-36 C). Nos três experimentos, foram obtidas larvas triplóides viáveis. Entretanto, nos experimentos I e II (com métodos químicos), observou-se elevada mortalidade das larvas, especialmente para o tratamento CB. A partir destes resultados, a substituição de CB por outros métodos de indução à triploidia é sugerida, devido ao seu elevado custo e elevada toxicidade para os seres humanos e para o meio ambiente.

Chemical and physical methods of triploidy induction in Crassostrea gigas (Thunberg, 1793) / Métodos químico e físico de indução à triploidia em Crassostrea gigas (Thunberg, 1793)

Three methods of triploidy (3N) induction were tested in diploid (2N) oysters Crassostrea gigas: two chemical methods cytochalasin-B (CB) and 6-dimethylaminopurine (6-DMAP), and one physical method with temperature shock. The objective was to evaluate the triploidy induction technology using flow cytometry as a tool to check the results of induction. The experiments were performed in separate and a seawater temperature in the tanks was maintained at 25 C for all experiments. In the experiment I, the efficacy of triploidy induction was evaluated using CB (0.5 mg L-1) and 6-DMAP (390 mols L-1). In the experiment II, the efficiency of triploidy induction was tested using CB (0.5 mg L-1) and 6-DMAP (450 mols L-1). In the experiment III, the efficiency of triploidy induction was evaluated using CB (0.5 mg L-1) and temperature shock (25 to 36 C). In all three experiments, viable triploid larvae were obtained. However, in the experiments I and II (with chemical methods), high mortality of larvae was observed, especially for the treatment CB. From these results, it is suggested the replacement of CB by other methods of triploidy induction, due to its high cost and high toxicity to humans and to the environment.(AU)

Três métodos de indução à triploidia (3N) foram testados em ostras diplóides (2N) (Crassostrea gigas); dois métodos químicos, citocalasina-B (CB) e 6-dimetilaminopurina (6-DMAP), e um método físico, com choque de temperatura. O objetivo foi avaliar a tecnologia de indução à triploidia, utilizando a técnica de citometria de fluxo como ferramenta para verificação dos resultados de indução. Os experimentos foram realizados em separado, sendo que a temperatura da água do mar foi mantida em 25 C em todos os tanques. No experimento I, foi avaliada a eficácia da indução à triploidia com CB (0,5 mg L-1) e 6-DMAP (390 mols L-1). No experimento II, foi testada a eficiência da indução à triploidia com CB (0,5 mg L-1) e 6-DMAP (450 mols L-1). No experimento III, foi avaliada a eficiência da indução à triploidia com CB (0,5 mg L-1) e choque de temperatura (25-36 C). Nos três experimentos, foram obtidas larvas triplóides viáveis. Entretanto, nos experimentos I e II (com métodos químicos), observou-se elevada mortalidade das larvas, especialmente para o tratamento CB. A partir destes resultados, a substituição de CB por outros métodos de indução à triploidia é sugerida, devido ao seu elevado custo e elevada toxicidade para os seres humanos e para o meio ambiente.(AU)

Vitrification of oocytes and in vitro produced bovine embryos exposed to cytochalasin B / Vitrificação de oócitos e embriões bovinos produzidos in vitro e expostos à citocalasina B

In this study, the influence of cytochalasin B on the survival and development after vitrification of oocytes and in vitro produced (IVP) bovine blastocysts was evaluated. In the Experiment I, 956 oocytes were matured for 22h and were immediately vitrified (Vitri treatment) or exposed for 15-20 minutes, to 7.5µg/ml (CB7.5Vitri treatment) or 45µg/ml (CB45Vitri treatment) cytochalasin B solutions, before vitrification. After 30 seconds of exposure to SV1 [400µl TCM-Hepes with 10% fetal serum (SF), 50µl ethylene glycol (EG) and 50µl DMSO], and 20 seconds to SV2 (300µl trehalose 1,0M + 20% SF, 100µl EG and 100µl DMSO) solutions, the oocytes were vitrified in Open Pulled Straws (OPS). The rewarming was performed at 37-38ºC in two steps of 5 minutes each, into 0.3 and 0.15M trehalose solutions, respectively. There was no difference (P>;0.05) in the cleavage and embryo rates between Vitri, Cito7.5Vitri and Cito45Vitri treatments, which were inferior to control group (P;0.05), which were lower than those observed in the Control group (P 0.05). The results show that, independently of dose studied (7.5 or 45mg/ml), cytochalasin B has not a beneficial effect to the vitrification of oocytes and IVP bovine blastocysts.

Foi avaliada a influência da citocalasina B na vitrificação de oócitos e embriões bovinos produzidos in vitro. No Experimento I, 956 oócitos foram maturados por 22h, sendo imediatamente vitrificados (tratamento Vitri) ou expostos por 15 a 20 minutos, à solução com 7,5µg/mL (tratamento CB7,5Vitri) ou 45µg/mL (tratamento CB45Vitri) de citocalasina B, antes da vitrificação. Após 30 segundos de exposição à SV1 [400µl TCM-Hepes com 10% soro fetal (SF), 50µl etilenoglicol (EG) e 50µl DMSO], e 20 segundos à SV2 (300µl trealose 1,0M + 20% SF, 100µl EG e 100µl DMSO), os oócitos foram vitrificados em palhetas estiradas (OPS). O reaquecimento foi realizado a 37-38ºC em duas etapas de 5 minutos cada, em trealose 0,3M e 0,15M. Não houve diferenças (P>;0,05) nos percentuais de clivagem e desenvolvimento embrionário entre os tratamentos Vitri, Cito7,5Vitri e Cito45Vitri, os quais foram inferiores (P;0,05) no percentual de re-expansão e eclosão entre os grupos Vitri e CB45Vitri, os quais foram inferiores (P 0,05) ao grupo controle. Os resultados indicam que, independentemente da dose utilizada, a exposição a citocalasina B não produz efeito benéfico na vitrificação de oócitos ou blastocistos bovinos produzidos in vitro.