Desarrollo de un sistema de fermentación líquida y de enquistamiento para una bacteria fijadora de nitrógeno con potencial como biofertilizante / Development of a liquid fermentation system and encystment for a nitrogen-fixing bacterium strain having biofertilizer potential

El uso indiscriminado de fertilizantes químicos ha contribuido al deterioro de las propiedades biológicas, físicas y químicas del suelo, lo que derivó en la pérdida de su capacidad productiva. Por esta razón, se ha planteado como alternativa tecnológica el uso de biofertilizantes. El objetivo de esta investigación fue desarrollar un sistema de fermentación líquida y de enquistamiento adecuado para la multiplicación de Azotobacter chroococcum cepa AC1, una bacteria utilizada en la formulación de un biofertilizante actualmente producido por CORPOICA, Colombia. Se emplearon diseños estadísticos secuenciales para determinar las condiciones del sistema de fermentación. Se evaluaron la interacción entre la agitación, la aireación y el pH sobre la biomasa viable obtenida de AC1 (UFC/ml), que se tomó como variable de respuesta. Además, se evaluó la capacidad de enquistamiento de esta bacteria empleando 2 agentes de enquistamiento, AE01 y AE02. La actividad potencial promotora del crecimiento vegetal fue evaluada por medio del ensayo de ARA (fijación biológica de nitrógeno), la técnica de azul de fosfomolibdeno (solubilización de fosfato) y la reacción colorimétrica empleando el reactivo de Salkowski (producción de compuestos indólicos). Se evidenciaron efectos significativos (p <0,05) sobre la producción de biomasa de los 3 factores evaluados (pH, aireación y agitación) individualmente, de una interacción dual y en la interacción tripartita, teniendo un efecto positivo sobre la variable de respuesta la aireación y agitación. La adición de los inductores de enquistamiento AE01 y AE02 demostró la capacidad de la cepa AC1 para formar quistes en condiciones de estrés. Asimismo, las condiciones de fermentación y el enquistamiento no afectaron las actividades biológicas evaluadas.

The indiscriminate use of chemical fertilizers has contributed to the deterioration of the biological, physical and chemical properties of the soil, resulting in the loss of its productive capacity. For this reason, the use of biofertilizers has emerged as a technological alternative. The objective of this research was to develop a suitable liquid fermentation system and encystment for the multiplication of Azotobacter chroococcum AC1 strain, a bacterium employed in a biofertilizer formulation produced at present by CARPOICA, Colombia. Sequential statistical designs were used to determine the conditions in the fermentation system. The interaction between agitation, aeration and pH was evaluated on the viable biomass (CFU/ml) of AC1. In addition, the encystment ability of the strain was evaluated using two encystment agents and the potential plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) activity was assessed by different techniques, such as nitrogen fixation by ARA, phosphate solubilization by the phospho-molybdenum-blue reaction and indolic compound production by colorimetric reaction using the Salkowski reagent. Results showed significant effects (p <0.05) on the viable biomass in the three conditions (pH, aeration and agitation) tested individually, in one dual interaction and one tripartite interaction, were demonstrated to have a positive effect on the response variable aeration and agitation. The addition of the two encystment agents evaluated, AE01 and AE02, demonstrated the ability of AC1 to form cysts under stress conditions. Likewise, fermentation and encystment conditions did not affect the biological activities tested.

[Development of a liquid fermentation system and encystment for a nitrogen-fixing bacterium strain having biofertilizer potential]. / Desarrollo de un sistema de fermentación líquida y de enquistamiento para una bacteria fijadora de nitrógeno con potencial como biofertilizante.

The indiscriminate use of chemical fertilizers has contributed to the deterioration of the biological, physical and chemical properties of the soil, resulting in the loss of its productive capacity. For this reason, the use of biofertilizers has emerged as a technological alternative. The objective of this research was to develop a suitable liquid fermentation system and encystment for the multiplication of Azotobacter chroococcum AC1 strain, a bacterium employed in a biofertilizer formulation produced at present by CARPOICA, Colombia. Sequential statistical designs were used to determine the conditions in the fermentation system. The interaction between agitation, aeration and pH was evaluated on the viable biomass (CFU/ml) of AC1. In addition, the encystment ability of the strain was evaluated using two encystment agents and the potential plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) activity was assessed by different techniques, such as nitrogen fixation by ARA, phosphate solubilization by the phospho-molybdenum-blue reaction and indolic compound production by colorimetric reaction using the Salkowski reagent. Results showed significant effects (p<0.05) on the viable biomass in the three conditions (pH, aeration and agitation) tested individually, in one dual interaction and one tripartite interaction, were demonstrated to have a positive effect on the response variable aeration and agitation. The addition of the two encystment agents evaluated, AE01 and AE02, demonstrated the ability of AC1 to form cysts under stress conditions. Likewise, fermentation and encystment conditions did not affect the biological activities tested.

Characterization of diazotrophic phosphate solubilizing bacteria as growth promoters of maize plants / Caracterización de bacterias diazotróficas solublizadoras de fosfato como promotoras de crecimiento en plantas de maíz

Phosphorus is limiting for growth of maize plants, and because of that use of fertilizers like rock phosphate has been proposed. However, direct use of rock phosphate is not recommended because of its low availability, so it is necessary to improve it. In this study, a group of diazotrophic bacteria were evaluated as phosphate-solubilizing bacteria, for their production of indolic compounds and for their effects on growth of maize plants. Strains of the genera Azosporillum, Azotobacter, Rhizobium and Klebsiella, were quantitatively evaluated for solubilization of Ca3(PO4)2 and Rock Phosphate as a single source of phosphorous in SRS culture media. Additionally, the phosphatase enzyme activity was quantified at pH 5.0, 7.0 and 8.0 using p-nitrophenyl phosphate, and production of indolic compounds was determined by colorimetric quantification. The effect of inoculation of bacteria on maize was determined in a completely randomized greenhouse experiment where root and shoot dry weights and phosphorus content were assessed. Results showed that strain C50 produced 107.2 mg.L-1 of available-P after 12 days of fermentation, and AC10 strain had the highest phosphatase activity at pH 8 with 12.7 mg of p-nitrophenol mL.h-1. All strains synthetized indolic compounds, and strain AV5 strain produced the most at 63.03 µg.mL-1. These diazotrophic bacteria increased plant biomass up to 39 % and accumulation of phosphorus by 10%. Hence, use of diazotrophic phosphate-solubilizing bacteria may represent an alternative technology for fertilization systems in maize plants.

El fósforo es limitante para el crecimiento de plantas de maíz y debido a eso se ha propuesto el uso de fertilizantes como la roca fosfórica. Sin embargo, el uso directo de roca fosfórica no es recomendado por su baja solubilidad, por lo que es necesario mejorarlo. En este estudio, un grupo de bacterias diazotróficas fueron evaluadas como bacterias solubilizadoras de fosfato, productoras de compuestos indólicos y sus efectos sobre el crecimiento de plantas de maíz. Cepas de los géneros Azospirillum, Azotobacter, Rhizobium y Klebsiella fueron evaluadas cuantitativamente en la solubilización de Ca3(PO4)2 y roca fosfórica como única fuente de fósforo en medio de cultivo SRS. Adicionalmente, la actividad de la enzima fosfatasa fue cuantificada a pH 5.0, 7.0 y 8.0 usando p-nitrofenil fosfato y, la producción de compuestos indólicos fue determinada por cuantificación colorimétrica. El efecto de la inoculación de las bacterias sobre plantas de maíz fue determinado en un experimento en invernadero con un diseño completamente al azar donde los pesos secos de raíz y hojas y el contenido de fósforo fueron evaluados. Los resultados mostraron que la cepa C50 produjo 107.2 mg.L-1 de fósforo disponible después de 12 días de fermentación y que la cepa AC10 tuvo la más alta actividad fosfatasa a pH 8 con 12.7 mg de p-nitrofenol mL.h-1. Todas las cepas sintetizaron compuestos indólicos y la cepa AV5 produjo la más alta cantidad con 63.03 µg.mL-1. Estas bacterias diazotróficas incrementaron la biomasa de las plantas por encima del 39 % y de la acumulación de fósforo por el 10 %. Aquí, el uso de bacterias diazotróficas solubilizadoras de fosfato puede representar una alternativa tecnológica para los sistemas de fertilización en plantas de maíz.

CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS DIAZOTRÓFICAS ASIMBIÓTICAS ASOCIADAS AL EUCALIPTO (Eucalyptussp.) EN CODAZZI, CESAR (COLOMBIA) / Characterization of Diazotrophic Bacteria Non-Symbiotic Associated with Eucalyptus (Eucalyptussp.) in Codazzi, Cesar (Colombia)

Se evaluó el efecto de las épocas climáticas (lluvia y sequía) y del estrato de la muestra (suelo rizosférico, raíces y hojas) sobre la población de los géneros Azotobacter, Beijerinckia, Derxia, Azospirillum, Herbaspirillum, Gluconacetobacter y Burkholderia en el Eucalipto (Eucalyptus sp.). Así mismo, se evalúo su capacidad en la producción de compuestos indólicos como promotores del crecimiento vegetal y su actividad de reducción de acetileno como indicador de la fijación biológica de nitrógeno. Los resultados no registraron diferencias estadísticas significativas en el test de Tukey (P ≤ 0.05) en la población con respecto a la época climática. Con respecto al estrato de muestra, los aislamientos tentativos de Herbaspirillum sp. y Azospirillum sp. presentaron diferencias significativas en suelo rizosférico y raíces. Se obtuvieron 44 aislamientos de los cuales se agruparon por caracterización fenotípica como: 14 presuntivos de Beijerinckia sp., 12 de Azotobacter sp., ocho de Derxia sp., cuatro de Herbarpirillum sp., cinco de Azospirillum sp., uno de Gluconacetobacter sp. y uno de Burkholderia sp. Por su alto potencial fueron seleccionados y criopreservados los aislamientos C27, C26 y C25, las cuales presentaron los mejores valores de eficiencia in vitro, superando valores de producción de las cepas de referencia utilizadas (A. chroococcum (AC1) y A. brasilense (SP7)).

The effect of climatic seasons (rainy and dry) and the stratum sample (rhizospheric soil, roots and leaves) the population of the genera Azotobacter, Beijerinckia, Derxia, Azospirillum, Herbaspirillum, Gluconacetobacter and Burkholderia in soil rhizosphere, roots and leaves of Eucalyptus (Eucalyptus sp.). It also assesses their ability to produce indoles compounds as plant growth promoters and their acetylene reduction activity as an indicator of biological fixation of nitrogen. The results showed no statistically significant differences in the Duncan test (P ≤ 0.05) in the population with respect to the climate epoch, suggesting that these bacteria are able to tolerate stress conditions by different physiological mechanisms. With respect to the stratum sample isolates attempts of Herbaspirillum sp. and Azospirillum sp. significant differences in rhizospheric soil and roots. We obtained 44 isolates of which were grouped by phenotypic characterization as 14 suspected of Beijerinckia sp., 12 Azotobacter sp., 8 Derxia sp., 4 Herbaspirillum sp., 5 Azospirillum sp., 1 Gluconacetobacter sp. and 1 Burkholderia sp. Due to their high potential were selected isolates C27, C26 and C25. These four strains present the best values of efficiency in vitro, exceeding production values of the reference strains used (A. chroococcum (AC1) and A. brasilense (SP7)).