Ação antifúngica da lactoferrina frente Candida non-albicans isoladas da cavidade oral de crianças infectadas pelo HIV / Antifungal action of lactoferrin against Candida non-albicans isolated from the oral cavity of HIV-infected children

A lactoferrina é uma glicoproteína de ligação ao ferro, que está presente na saliva, no leite, e em outras secreções exócrinas. Essa proteína tem inúmeras funções biológicas, incluindo efeitos antifúngicos e antibacterianos, além de imunomoduladores. O objetivo do presente estudo foi avaliar, in vitro, pela primeira vez, a atividade antifúngica da lactoferrina contra cepas de Candida nãoalbicans isoladas da cavidade oral de crianças infectadas pelo HIV e crianças saudáveis. Além disso, mensurar a degradação da lactoferrina por essas cepas através de SDS-PAGE (análise eletroforética em gel de poliacrilamida) e determinar, in vitro, a concentração mínima inibitória de lactoferrina capaz de matar 50% das células de Candida não-albicans. Cepas de Candida spp. foram obtidas através da coleta de saliva de 70 crianças infectadas pelo HIV e 50 crianças sem evidências de imunossupressão, com idade de 3 a 13 anos (ALVES, 2014). As diferentes espécies de Candida foram identificadas através de assimilação e fermentação de açúcar (API 20C, Biomérieux, França). Para o ensaio, in vitro, de morte de celular na presença de lactoferrina, 24 isolados de Candida, entre elas parapsilosis, tropicalis, krusei, guillermondi e dubliniensis, foram selecionados. Para a realização da análise por SDS-PAGE, cepas de todas as espécies consideradas resistentes nos ensaios de morte celular, foram incluídas. O porcentual de morte celular (%) de Candida não- albicans com a adição de 100 µg/ml de lactoferrina variou de 3,1% (C. dubliniensis) a 88,1% (C. tropicalis) no grupo HIV, e de 14,1% a 30,37% no grupo não-HIV (C . parapsilosis). Não houve correlação entre a densidade celular e o percentual de morte celular. C. dubliniensis foi a espécie mais resistente a lactoferrina e o porcentual de morte celular de C. parapsilosis foi significativamente maior em comparação com C. krusei na concentração de 1X104 células/ml (p = 0,033). Todos os isolados foram capazes de degradar a lactoferrina na concentração 1x108 células/ml, especialmente C. parapsilosis, pelo grupo HIV. Além disso, a lactoferrina na concentração de 500 µg/ml foi capaz de matar mais de 50% das células apenas dos isolados de C. tropicalis e C. guilliermondii. Concluiu-se que a lactoferrina tem atividade antifúngica contra Candida não-albicans de crianças infectadas pelo HIV, mas algumas espécies apresentam alguma resistência a esta proteína. Além disso, todas as Candida spp. foram capazes de degradar a lactoferrina quando estavam em concentração de 1X108 cels/ml, e a lactoferrina na concentração de 500µl/ml foi capaz de matar mais que 50% das células de C. tropicalis e C. guillermondii

Lactoferrin is an iron-binding glycoprotein, which is present in saliva, milk and other exocrine secretions. This protein has a number of biological functions, including antifungical, antimicrobial and immunomodulatory effects. The aim of this study was to evaluate, for the first time, the antifungal activity of lactoferrin against isolates of Candida spp. from the oral cavity of HIV-infected children and children with no clinical evidence of immunosuppression. Furthermore, measure, in vitro, the degradation of lactoferrin by Candida spp. through SDS-PAGE (electrophoretic analysis on polyacrylamide gel) and determine, in vitro, the minimum inhibitory concentration of lactoferrin able to kill 50% of cells of Candida non-albicans. Strains of Candida spp. were obtained through saliva collect of 70 HIV-infected children and 50 children without evidence of immunosuppression ageing between 3 to13 years old (ALVES, 2014). All Candida species were identified by sugar assimilation and fermentation (API 20C, Biomerieux, France). For the in vitro study, death of lactoferrin of 24 Candida isolates, including parapsilosis, tropicalis, krusei, guillermondii, and dubliniensis, were selected. To perform the analysis by SDS-PAGE, strains of all available species considered resistants, which were observed at lactoferrin death`s study, were included. The cell death percentage (%) of non-albicans Candida by addition of 100 µg of lactoferrin range from 3.1% (C. dublinienes) to 88.1% (C. tropicalis) in HIV group, and 14.1% to 30.37% in N-HIV (C. parapsilosis), but there was no correlation between cell density and death %. C. dubliniensis was the most resistant specie to lactoferrin and the cell death % of C. parapsilosis was significant higher comparing to C. krusei at 1X104 cells/ml (p=0.033). All the isolates were able to degrade lactoferrin at 108 cells/ml, mainly C. parapsilosis from HIV. Furthermore, lactoferrin at 500 µg/ml concentration was able to kill more than 50% of the cells only for C. tropicalis and C. guillermondii isolates. It was concluded that lactoferrin has antifungal activity against non-albicans Candida from HIV children, but some species present some resistance to this protein. Furthermore, all Candida spp. were able to degrade lactoferrin when was at concentration of 1x108 cells / ml, also, lactoferrin at concentration 500µl / ml was able to kill more than 50% of C. tropicalis and C. guillermondii cells.

Potencial cariogênico de Candida não-albicans isoladas do biofilme dentário de crianças infectadas pelo HIV / Cariogenic potential of Candida non-albicans isolated from the dental biofilm of HIV-infected children

O objetivo deste estudo foi analisar, in vitro, o padrão de desmineralização do esmalte bovino exposto a C. não-albicans isoladas de biofilme dental de crianças infectadas pelo HIV, em comparação com C. albicans (n = 2) e Streptococcus (S) mutans (ATCC). Também foram avaliadas as formações de biofilme e produção de L-lactato por estas espécies não-albicans. Cento e oitenta blocos de esmalte foram divididos em 6 grupos com biofilme formado por: C. glabrata; C. parapsilosis; C. tropicalis; C. albicans; S. mutans e controle negativo (meio sem biofilme). Três blocos de esmalte de cada grupo foram retirados nos dias 3, 5, 8, 15 e 28 após a formação de biofilme para avaliar a microdureza superficial do esmalte final (SMH). Além disso, a viabilidade das células do biofilme e o L-lactato produzidos por estas células foi medida por redução de XTT e enzimaticamente, respectivamente. Análise microscópica de varrimento laser confocal (CLS) foi utilizado para avaliar a topografia de cada isolado de biofilme de C. não-albicans. Os resultados da análise de SMH foram submetidos a testes de Mann-Whitney de Kruskall-Wallis e com um nível de significância de 95% (p <0,05), enquanto que os dados de viabilidade do biofilme, L-lactato e análise CLS foram avaliadas de forma descritiva. Todos os grupos mostraram um aumento na perda de SMH, mas apenas os grupos expostos a biofilmes de S. mutans e C. albicans foram estatisticamente significativas ao longo do tempo. Ao comparar as espécies C. não-albicans entre si, C. tropicalis apresentaram maior perda% no 5 º dia em comparação com C. parapsilosis e no 8 º dia em comparação com C. glabrata. Não foi observada diferença estatística entre C. parapsilosis e C. glabrata. Todos os isolados de C. não-albicans mostraram o mesmo perfil de formação de biofilme. A produção de L-lactato foi maior em C. tropicalis seguido por C. glabrata e C. parapsilosis. No entanto, a análise mostrou CLS C. parapsilosis biofilme com mais células viáveis e com a matriz extracelular mais. Embora com menor intensidade em comparação com C. albicans e S. mutans, os isolados de Candida não-albicans do biofilme dental de crianças infectadas pelo HIV, foram capazes de causar a desmineralização do esmalte bovino. (AU)

This study aimed to analyzed , in vitro, the demineralization pattern of bovine enamel exposed to biofilm of C. non-albicans isolated from dental biofilm of HIV infected children, comparing to C. albicans (n=2) and Streptococcus (S) mutans (ATCC).We also evaluated the biofilm formations and the production of L-lactate by these nonalbicans species. A hundred eigthy enamel blocks randomly assigned to 6 groups with biofilm formed by: C. glabrata; C. parapsilosis; C. tropicalis; C. albicans; S. mutans and negative control (medium without biofilm). Three enamel blocks from each group were removed on days 3, 5, 8, 15 and 28 after biofilm formation to evaluate the final enamel surface microhardness (SMH). In addition, the cells viability of the biofilm and the L-lactate produced by these cells were measured by XTT reduction and enzymatically, respectively. Confocal laser scanning microscopic (CLS) analysis was used to evaluate the biofilm architecture of each C. non-albicans isolate. The results from SMH analysis were subjected to Kruskall-Wallis and MannWhitney tests with a 95% significance level (p<0.05), while the data from biofilm viability, L-lactate and CLS analysis were evaluated descriptively. All groups showed an increase in loss of SMH but only the groups exposed to biofilms from S. mutans and C. albicans were statistically significant over time. When comparing the species C. non-albicans among themselves, C. tropicalis showed a greater % loss on the 5th day compared with C. parapsilosis and at the 8th day compared to c. glabrata. No statistical difference betwwen C. parapsilosis and C. glabrata was observed. All isolates from C. non-albicans showed the same profile of biofilm formation. The Llactate production was higher in C. tropicalis followed by C. glabrata and C. parapsilosis. However, the CLS analysis showed C. parapsilosis biofilm with more viable cells and with more extracellular matrix. Although with less intensity comparing to C. albicans and S. mutans, isolates of Candida non-albicans from HIV infected children dental biofilm, were able to cause demineralization of bovine enamel. (AU)

Fatores de virulência de Candida spp. isoladas da cavidade bucal de crianças infectadas pelo HIV / Virulence factors of Candida spp. isolated from the oral cavity of HIV-infected children

Candida spp. são responsáveis por infecções graves em indivíduos imunossuprimidos. Diversos fatores de virulência contribuem para sua transição de comensais a patógenos, como a formação de biofilme, produção de fosfolipase, produção de protease e a resistência a antifúngicos. O objetivo deste estudo in vitro foi avaliar a formação de biofilme, produção de fosfolipase e protease e a susceptibilidade ao Fluconazol de isolados Candida spp., provenientes da saliva de crianças infectadas pelo HIV (Grupo HIV) e crianças saudáveis (Grupo controle). Também estes fatores foram correlacionados com o uso do HAART, estado imunológico, presença de AIDS e carga viral do grupo HIV. Foi analisado um total de 79 isolados, sendo 48 isolados de C. albicans (33/15) e 20 isolados do complexo C. parapsilosis lato sensu (12/8) dos grupos HIV e controle, respectivamente, e isolados de C. krusei (8), C. tropicalis (1), C. dubliniensis (1) e C. guilliermondii (1) do grupo HIV. Dados médicos e laboratoriais (CD4%, carga viral) foram coletados dos respectivos prontuários médicos. A formação de biofilme foi avaliada pela redução do XTT. Isolados de cada espécie com a habilidade de formar maior quantidade de biofilme maduro (grupo HIV) foram submetidos à microscopia confocal de fluorescência para a visualização da morfologia e estrutura do biofilme. As análises da produção de fosfolipase e protease se deram por meio da metodologia de placas de àgar de gema de ovo e Albumina de Soro Bovino, respectivamente. A susceptibilidade ao Fluconazol foi determinada por meio da técnica de microdiluição. Todos os isolados formaram biofilme (n= 79) e quantitativamente, esta formação foi semelhante em ambos os grupos (p>0.05). A formação de biofilme dos isolados de C. albicans foi maior do que a dos isolados de Candida não-albicans (p<0.05).A atividade de fosfolipase foi detectada em 40,5% (32/79) de todos os isolados e foi significativamente maior no grupo HIV (p=0.006) e nos isolados de C. albicans deste grupo (p=0,007). A atividade de protease foi detectada em 66 isolados (84,8%) e em ambos os grupos a maioria era produtor relativamente forte ou muito forte. Trinta e três (33/41, 7%) isolados eram resistentes ao Fluconazol, sendo 42,9% do grupo HIV e 39,1% do grupo controle. Não foi observada correlação entre a expressão dos fatores de virulência e os dados médicos relativos ao grupo HIV. No entanto, a expressão dos fatores de virulência dos isolados orais de Candida spp. de crianças infectadas pelo HIV se mostrou acentuada. Este achado pode destacar o papel da imunossupressão na regulação da expressão dos fatores de virulência de Candida spp (AU)

Candida species are responsible for life threatening infections in severely immunocompromised individuals. Several virulence attributes support their transition from commensal to parasite, as the biofilm formation, secretion of phospholipase, protease and the resistance to antifungals. The aims of this study were to assess the in vitro biofilm formation, phospholipase production, protease production and the susceptibility to Fluconazole of Candida spp. recovered from the saliva of HIV infected children and controls. Also, to correlate these features with the use of HAART, immunological status, presence of AIDS and viral load of HIV group. A total of 79 isolates were analyzed: 48 C. albicans isolates (33/15) and 20 C. parapsilosis sensu lato complex isolates (12/8) from HIV and control patients, respectively, while C. krusei (8), C. tropicalis (1), C. dubliniensis (1) and C. guilliermondii (1) from HIV patients only. Medical data was collected, considering antiretroviral therapy, CD4 count and viral load. The biofilm forming ability was analyzed through the XTT reduction assay technique. Representative isolates of each specie with the ability to form more quantity of mature biofilm (HIV group) underwent confocal laser scanning microscopy for the visualization of biofilm morphology and structure. Phospholipase and protease assays were performed through the egg yolk and Bovine Serum Albumin agar plate methods, respectively. Fluconazole susceptibility was determined through the microdilution assay. All isolates were able to form biofilm (n= 79). Quantitatively, Candida isolates from HIV-positive and negative children presented similar ability to form biofilm (p>0.05). In C. albicans isolates from both, HIV and control groups, the biofilm formation was higher than in non-albicans Candida isolates (p<0.05).Phospholipase activity was detected in 40.5% (32/79) of all isolates. Its activity was significantly higher in HIV group (p=0.006) and C. albicans isolates from HIV group (p=0.007). Protease activity was detected in 66 isolates (84.8%) and most of them from both groups were relatively/very strong producers. Thirty three (33/41.7%) of all isolates were resistant to Fluconazole. Most non-albicans Candida isolates from HIV (87.0%) and control (87.5%) groups were susceptible to this drug. No significant difference was detected between groups in biofilm, protease and Fluconazole susceptibility assays. Correlation with medical data in HIV group was not found. Candida spp. isolates of HIV-positive children present increased virulence expression due to significant higher in vitro phospholipase production. This finding may enlighten the relevant role played by immunosuppression in the modulation of Candida virulence attributes (AU)