Steps of cryopreservation of coffee seeds: physiological responses and antioxidant systems / Etapas da criopreservação de sementes de café: respostas fisiológicas e de sistemas antioxidantes

The cryopreservation of plant germplasm at ultralow temperatures is an alternative technique for the long-term storage of seeds of the genus Coffea sp. However, for this technique to be successful, cell integrity must be maintained at all stages of the process on the basis of scientific research. The present study investigated validated cryopreservation protocols for Coffea arabica L. seeds and evaluate the effects on the physiological and biochemical characteristics of the seeds at each stage of the process. Seeds were dried on silica gel or with saturated saline solution, precooled or not in a biofreezer, immersed in nitrogen, and reheated in a water bath. After each of these steps, the physiological and biochemical quality of the seeds was determined. Pre-cooling is a step that can be dispensed with in the cryopreservation of Coffea arabica seeds, direct immersion in liquid nitrogen being more indicated. Coffea arabica L. seeds tolerate cryopreservation after rapid drying in silica gel up to water contents of 17 or 20% (wb), with greater survival at 17%. The enzyme activities of catalase, polyphenol oxidase and peroxidase are indicators of the quality of C. arabica L. seeds subjected to cryopreservation.

A criopreservação de germoplasma vegetal em temperaturas ultrabaixas é uma alternativa para o armazenamento em longo prazo de sementes do gênero Coffea sp. Entretanto, para que essa técnica apresente sucesso, a realização de pesquisas que garantam a manutenção da integridade celular em todas as etapas do processo é de fundamental importância. O objetivo com o presente trabalho foi investigar protocolos de criopreservação validados para sementes de Coffea arabica L., avaliando separadamente, os efeitos sobre as características fisiológicas e bioquímicas das sementes, em cada etapa do processo. As sementes foram secadas em sílica gel ou em solução salina saturada, submetidas ou não ao pré-resfriamento em biocongelador, em seguida imersas no nitrogênio e reaquecidas em banho-maria. Após cada uma dessas etapas, a qualidade fisiológica e bioquímica das sementes foi determinada. O pré-resfriamento é uma etapa que pode ser dispensada na criopreservação de sementes de Coffea arabica, sendo mais indicada a imersão direta em nitrogênio líquido. Sementes de Coffea arabica L. toleram a criopreservação após secagem rápida em sílica gel até teores de água de 17 ou 20% (wb), com maior sobrevivência a 17%. A atividade das enzimas catalase, polifenoloxidase e peroxidase são indicadoras da qualidade de sementes de Coffea arabica L. submetidas à criopreservação.

Evaluación del semen canino, sometido a congelación con diferentes concentraciones de glicerol como crioprotector / Evaluation of canine semen that has gone through a freezingand thawing process with different glycerol concentrations as a crioprotector / Avaliação do sêmen canino, sujeito a congelamento com diferentes concentrações de glicerol como crioprotetor

El estudio de las biotecnologías usadas con fines reproductivos en caninos, constituye uno de los principalespuntos de estudio investigativo para el campo de la Medicina Veterinaria y la Zootecnia en los últimos años 28. Conel objetivo de evaluar el efecto de tres diferentes concentraciones de glicerol sobre el semen canino sometido aprocesos de criopreservación, se obtuvieron por medio de manipulación manual, 12 muestras seminales de machos de la raza labrador, clínicamente sanos y sometidos a las mismas condiciones de manejo. Cada muestra se dividió en cuatro tratamientos (T1: control, T2: 4%, T3: 6% y T4: 8% de glicerol); a los cuales se les evaluó el volumen,pH, movilidad, concentración, morfología y vitalidad, respectivamente. Luego en el análisis pos descongelaciónse determinaron las diferencias seminales y se estableció su relación con la concentración del crioprotector. De los resultados obtenidos en este proyecto se encontraron diferencias significativas entre las variables morfología, mortalidad y concentración, igualmente se estableció que los tratamientos T2 (4% de glicerol) y T3 (6% de glicerol) presentaron mejores resultados para la congelación de semen en caninos.

The study of biotechnology used in canines for reproductive purposes, is a of the principal research study points tothe area of Veterinary Medicine in last years28. In the objective to evaluate the effect of three different concentrationsof glycerol on canine semen, to subjected cryo-preservation process, were obtained using manual manipulation, 12semen samples of male Labrador clinically healthy and subject to the same driving conditions. Each sample was divided in four treatments (T1: control, T2: 4%, T3: T4 6% and 8% glycerol), to which they evaluated the volume, pH, motility, concentration, morphology and vitality, respectively. Then in the analysis were determined after thawing seminal differences and its relationship to the concentration of cryoprotectant. From the results obtained in this project are significant differences between the variables morphology, mortality and concentration, also establishedthat T2 (4% glycerol) and T3 (6% glycerol) provide better results for freezing semen canines.

O estudo da biotecnologia utilizada em cães para fins reprodutivos constitui um dos principais pontos de pesquisapara o campo da medicina veterinária e zootecnia nos últimos anos28. Com o objetivo de se avaliar o efeito de trêsdiferentes concentrações de glicerol sobre sêmen canino submetidos a processos crioconservação, foram obtidaspor meio de manipulação manual 12 amostras de sêmen de Labrador macho, clinicamente saudáveis e submetidasàs mesmas condições de manejo. Cada amostra foi dividida em quatro tratamentos (T1: controle, T2: 4%, T3: 6% e T4: 8% de glicerol), os quais foram avaliados quanto ao volume, pH, mobilidade, concentração, morfologia evitalidade, respectivamente. Nas análises pós descongelamento foram determinadas as diferenças entre os semens e se estabeleceu uma relação com a concentração do crioprotetor. A partir dos resultados obtidos neste trabalho foram encontradas diferenças significativas entre a variável morfologia, mortalidade e concentração e também ficou estabelecido que T2 (4% de glicerol) e T3 (6% de glicerol) apresentaram os melhores resultados para o congelamento de sêmen em caninos.

Análise dos grãos de pólen de diferentes cultivares de manona (ricinus communis l., euphorbiaceae): conservação e viabilidade

ABSTRACT The analysis of the pollen grain fertility of Riccinus communis (castor-oil plant) is of great importance for breeding programs, allowing for suitable handling and use of collections and the creation of cultivars of interest for biodiesel production. In this work, a predictive process was chosen based on the cytological method of pollen-grain staining and in-vitro pollen germination after low-temperature treatments for preservation to verify the pollen viability, which is important in seed fertilization and formation. The conventional cytological staining technique with 2% acetic carmine was used for pollen grain viability analysis for the cultivars IAC-80, Cafelista, AL-Preta and AL-Guarany 2002, while the method of in-vitro germination after treatment at -196° C, -80° C and -18° C, from 15 to 30 days, was used for the cultivar IAC-80. The IAC-80 and Cafelista cultivars showed pollen viability values above 95%, while AL-Preta and AL-Guarany 2002 showed 88.48 and 86.46%, respectively. The pollen grains of castor-oil cultivars also presented a high percentage of pollen viability at anthesis. Therefore, it is possible to use the pollen grains of all the analyzed cultivars for fertilization induction in breeding programs. The results indicate that the average percentage of the pollen-grain viability in-vivo was not influenced by the storage period. It was also observed that there were differences among the low-temperature treatments, although the percentage of viability was low, suggesting the need for the application of a suitable evaluation technique.

RESUMO A análise da fertilidade dos grãos de pólen de Ricinus communis (mamona) é de grande importância para programas de melhoramento, permitindo o manejo e uso adequado das coleções existentes e a criação de cultivares interessantes na produção de biodiesel. Neste trabalho, optou-se por um processo preditivo baseado no método citológico de coloração dos grãos de pólen e no método de germinação in vitro dos grãos, após tratamentos de conservação a baixas temperaturas, para a verificação da viabilidade, importante na formação das sementes, alvo dos programas de melhoramento. Utilizou-se a técnica de coloração com carmim acético 2% na análise da viabilidade dos grãos de pólen nas cultivares IAC-80, Cafelista, AL-Preta e AL-Guarany 2002, enquanto que o método de germinação in vitro após tratamento de -196° C, -80° C e -18° C, por 15 e 30 dias, foi aplicado somente na cultivar IAC-80. A viabilidade polínica foi acima de 95% em IAC-80 e Cafelista de 88,48% em AL-Preta e de 86,46% em e AL-Guarany 2002. Estas cultivares apresentaram também alto percentual de viabilidade polínica na antese, sendo possível a utilização de todas as cultivares analisadas na indução de fertilização em programas de melhoramento. Os resultados obtidos com a germinação in vitro dos grãos de IAC-80, após a criopreservação, indicaram que o percentual médio da viabilidade polínica in vivo não foi influenciado pelo período de armazenamento. Observaram-se diferenças entre os tratamentos a baixas temperaturas, porém o percentual de viabilidade dos mesmos foi baixo, sugerindo necessidade de adequação na técnica de avaliação.

Desempenho reprodutivo de Nasonia vitripennis Walker (Hymenoptera: Pteromalidae) em pupas crioconservadas de Chrysomya megacephala Fabricius (Diptera: Calliphoridae): avaliação preliminar

The reproductive performance of Nasonia vitripennis Walker (Hymenoptera: Pteromalidae) was evaluated on pupae of Chrysomya megacephala Fabricius (Diptera: Calliphoridae) kept at -20ºC, during 77 days, with and no previous passage for liquid nitrogen (NL) by one, three and 15 minutes. Control groups were characterized for fresh pupae hosts. There was one pupa for each parasitoid. The sample of fresh pupae exhibited average of 15 emergent parasitoids / pupa while pupae stored directly at freezer (-20ºC) presented an average of 10 emergent parasitoids / pupa. In the samples exposed at one, three and 15 minutes in NL, accentuated decrease was observed on emergent hymenopterans reproductive performance ( img border=0 id="_x0000_i1028" src="../../../../img/revistas/cr/v34n1/n1a32fr01.gif">: 6.1; 5.5 and 5.7 respectively). The dissection of pupae revealed a large number of immature pteromalid in the groups with liquid nitrogen passage and farate adults in all the groups.

Avaliou-se o desempenho reprodutivo de Nasonia vitripennis Walker (Hymenoptera: Pteromalidae) em pupas de Chrysomya megacephala Fabricius (Diptera: Calliphoridae) previamente armazenadas a - 20ºC de temperatura, durante 77 dias, com e sem passagem prévia em nitrogênio líquido (NL) por um, três e 15 minutos. O grupo controle foi caracterizado por pupas hospedeiras frescas. Os muscóides foram expostos aos parasitóides durante 72 horas. Utilizou-se a relação de uma pupa muscóide por fêmea parasitóide. A amostra de pupas frescas permitiu a emergência de 15 parasitóides/ pupa, em média, enquanto 10 parasitóides / pupa emergiram dos espécimens prévia e diretamente armazenados em freezer (-20ºC). Observou-se um acentuado decréscimo do desempenho reprodutivo dos microhimenópteros que exploraram os substratos previamente submetidos ao NL durante um, três e 15 minutos ( img border=0 id="_x0000_i1026" src="../../../../img/revistas/cr/v34n1/n1a32fr01.gif">: 6,1; 5,5 e 5,7, respectivamente). A dissecação das pupas hospedeiras revelou um expressivo número de pteromalídeos imaturos, nas amostras que foram expostas ao NL, e de adultos faratos, em todos os tratamentos

Sobrevivência de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificados em meio contendo 9,0m de etileno glicol na presença de sacarose

The aim of these experiments was to determine the in vitro and in vivo survivability of Mus domesticus domesticus blastocysts, following exposure and vitrification in modified PBS solution containing 9.0M of ethylene glycol (EG) and 0.3M of sucrose. The cryoprotectant solutions were denominated I (without sucrose) and IS (with sucrose) when the embryo exposure to the solutions has been done in two steps. First the embryos were exposed to a modified PBS solution with 1,8M EG + 6% BSA during 2 minutes, and after they were transferred to straws containing modified PBS plus 9.0M EG + 6% BSA and after 30 seconds immersed into liquid nitrogen. The others cryoprotectant solutions, denominated II (without sucrose) and IIS (with sucrose) the embryos were exposed directly to the 9.0M EG and after 30 seconds plunged into the liquid nitrogen. In the first experiment a survival rate of 299 blastocysts was observed following exposure to cryoprotectant solutions. There was no statistical diference among control and treatment groups. The experiment II allowed to evaluate the in vitro embryo survival, after vitrification of 330 blastocysts, the cryoprotectant solutions I and IS determinated statistically different (p 0.05) embryo survival rates, showing in vitro hatching rates of 49 and 40%, respectively. In experiment 3, 141 blastocysts were exposed to the cryoprotectant solutions I and IS, vitrified and then transferred into the recipients. The number of implantations and fetuses were observed after 14 days of gestation. There was no statistical difference (p>0.05) among the solutions I and IS in the number of implantations (37 and 32%) and fetuses (27 and 27%), respectively. The survival rate of Mus domesticus domesticus blastocysts did not improve with the addition of sucrose to the vitrification solution containing 9.0M of EG.

Os experimentos realizados tiveram como objetivo determinar a taxa de sobrevivência in vitro e in vivo de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificados em meio contendo 9,0M de etileno glicol e 0,3M de sacarose. As soluções testadas foram denominadas de I e IS, quando a adição do crioprotetor foi realizada em duas etapas, e II e IIS, quando a adição deste foi realizada em apenas uma etapa. Na solução de vitrificação I, foi realizada inicialmente uma desidratação prévia dos embriões por um período de 2 minutos em solução de 1,8M de EG em PBS + 6% de BSA e, logo após, eles foram transferidos, por um período de 30 segundos, para a solução composta por uma associação de 9,0M de EG em PBS + 6% de BSA, antes da imersão em nitrogênio líquido. Na solução de vitrificação IS, o procedimento foi idêntico ao da solução I, apenas com o acréscimo de 0,3M de sacarose às soluções crioprotetoras. Na solução de vitrificação II, os embriões foram expostos diretamente a uma solução composta por uma associação de 9,0M de EG em PBS + 6% de BSA, onde permaneciam por 30 segundos antes da imersão em nitrogênio líquido. Na solução de vitrificação IIS, o procedimento foi idêntico ao da solução II, apenas com a adição de 0,3M de sacarose à solução crioprotetora. No experimento I, foi determinada a taxa de sobrevivência de 299 blastocistos após a exposição às soluções crioprotetoras, não sendo observada diferença estatística entre os tratamentos e o grupo controle. O experimento II permitiu avaliar a sobrevivência embrionária in vitro (taxa de eclosão) após a vitrificação de 330 blastocistos, onde as soluções I e IS foram estatisticamente superiores às demais, apresentando taxas de eclosão de 49 e 40%, respectivamente. No experimento III, realizou-se a transferência de 141 blastocistos vitrificados, após a exposição às soluções I e IS, para fêmeas receptoras. Não houve diferenças estatísticas entre as taxas de sobrevivência embrionária determinadas aos 14 dias de prenhez, tanto para implantações (37 e 32%) quanto para fetos (27 e 27%), respectivamente. A presença de sacarose na solução de vitrificação não proporcionou uma maior sobrevivência de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificados em uma solução contendo 9,0M EG.

Sobrevivência de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificados em meio contendo 9,0m de etileno glicol na presença de sacarose

The aim of these experiments was to determine the in vitro and in vivo survivability of Mus domesticus domesticus blastocysts, following exposure and vitrification in modified PBS solution containing 9.0M of ethylene glycol (EG) and 0.3M of sucrose. The cryoprotectant solutions were denominated I (without sucrose) and IS (with sucrose) when the embryo exposure to the solutions has been done in two steps. First the embryos were exposed to a modified PBS solution with 1,8M EG + 6% BSA during 2 minutes, and after they were transferred to straws containing modified PBS plus 9.0M EG + 6% BSA and after 30 seconds immersed into liquid nitrogen. The others cryoprotectant solutions, denominated II (without sucrose) and IIS (with sucrose) the embryos were exposed directly to the 9.0M EG and after 30 seconds plunged into the liquid nitrogen. In the first experiment a survival rate of 299 blastocysts was observed following exposure to cryoprotectant solutions. There was no statistical diference among control and treatment groups. The experiment II allowed to evaluate the in vitro embryo survival, after vitrification of 330 blastocysts, the cryoprotectant solutions I and IS determinated statistically different (p 0.05) embryo survival rates, showing in vitro hatching rates of 49 and 40%, respectively. In experiment 3, 141 blastocysts were exposed to the cryoprotectant solutions I and IS, vitrified and then transferred into the recipients. The number of implantations and fetuses were observed after 14 days of gestation. There was no statistical difference (p>0.05) among the solutions I and IS in the number of implantations (37 and 32%) and fetuses (27 and 27%), respectively. The survival rate of Mus domesticus domesticus blastocysts did not improve with the addition of sucrose to the vitrification solution containing 9.0M of EG.

Os experimentos realizados tiveram como objetivo determinar a taxa de sobrevivência in vitro e in vivo de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificados em meio contendo 9,0M de etileno glicol e 0,3M de sacarose. As soluções testadas foram denominadas de I e IS, quando a adição do crioprotetor foi realizada em duas etapas, e II e IIS, quando a adição deste foi realizada em apenas uma etapa. Na solução de vitrificação I, foi realizada inicialmente uma desidratação prévia dos embriões por um período de 2 minutos em solução de 1,8M de EG em PBS + 6% de BSA e, logo após, eles foram transferidos, por um período de 30 segundos, para a solução composta por uma associação de 9,0M de EG em PBS + 6% de BSA, antes da imersão em nitrogênio líquido. Na solução de vitrificação IS, o procedimento foi idêntico ao da solução I, apenas com o acréscimo de 0,3M de sacarose às soluções crioprotetoras. Na solução de vitrificação II, os embriões foram expostos diretamente a uma solução composta por uma associação de 9,0M de EG em PBS + 6% de BSA, onde permaneciam por 30 segundos antes da imersão em nitrogênio líquido. Na solução de vitrificação IIS, o procedimento foi idêntico ao da solução II, apenas com a adição de 0,3M de sacarose à solução crioprotetora. No experimento I, foi determinada a taxa de sobrevivência de 299 blastocistos após a exposição às soluções crioprotetoras, não sendo observada diferença estatística entre os tratamentos e o grupo controle. O experimento II permitiu avaliar a sobrevivência embrionária in vitro (taxa de eclosão) após a vitrificação de 330 blastocistos, onde as soluções I e IS foram estatisticamente superiores às demais, apresentando taxas de eclosão de 49 e 40%, respectivamente. No experimento III, realizou-se a transferência de 141 blastocistos vitrificados, após a exposição às soluções I e IS, para fêmeas receptoras. Não houve diferenças estatísticas entre as taxas de sobrevivência embrionária determinadas aos 14 dias de prenhez, tanto para implantações (37 e 32%) quanto para fetos (27 e 27%), respectivamente. A presença de sacarose na solução de vitrificação não proporcionou uma maior sobrevivência de blastocistos Mus domesticus domesticus vitrificados em uma solução contendo 9,0M EG.