Resveratrol Alleviates Osteoporosis by Promoting Osteogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells via SITR1/PI3K/AKT Pathway / El Resveratrol Alivia la Osteoporosis al Promover la Diferenciación Osteogénica de las Células Madre Mesenquimales de la Médula Ósea a Través de la Vía SITR1/PI3K/AKT

SUMMARY: Senile osteoporosis is mainly caused by reduced osteoblast differentiation and has become the leading cause of fractures in the elderly worldwide. Natural organics are emerging as a potential option for the prevention and treatment of osteoporosis. This study was designed to study the effect of resveratrol on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in osteoporosis mice. A mouse model of osteoporosis was established by subcutaneous injection of dexamethasone and treated with resveratrol administered by gavage. In vivo and in vitro, we used western blot to detect protein expression, and evaluated osteogenic differentiation of BMSCs by detecting the expression of osteogenic differentiation related proteins, calcium deposition, ALP activity and osteocalcin content. Resveratrol treatment significantly increased the body weight of mice, the level of serum Ca2+, 25(OH)D and osteocalcin, ration of bone weight, bone volume/total volume, trabecular thickness, trabecular number, trabecular spacing and cortical thickness in osteoporosis mice. In BMSCs of osteoporosis mice, resveratrol treatment significantly increased the expression of Runx2, osterix (OSX) and osteocalcin (OCN) protein, the level of calcium deposition, ALP activity and osteocalcin content. In addition, resveratrol treatment also significantly increased the expression of SIRT1, p-PI3K / PI3K and p-AKT / AKT in BMSCs of osteoporosis mice. In vitro, resveratrol increased the expression of SIRT1, p-PI3K / PI3K and p-AKT / AKT, Runx2, OSX and OCN protein, the level of calcium deposition, ALP activity and osteocalcin content in BMSCs in a concentration-dependent manner, while SIRT1 knockdown significantly reversed the effect of resveratrol. Resveratrol can attenuate osteoporosis by promoting osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, and the mechanism may be related to the regulation of SIRT1/PI3K/AKT pathway.

La osteoporosis senil es causada principalmente por una diferenciación reducida de osteoblastos y se ha convertido en la principal causa de fracturas en las personas mayores en todo el mundo. Los productos orgánicos naturales están surgiendo como una opción potencial para la prevención y el tratamiento de la osteoporosis. Este estudio fue diseñado para estudiar el efecto del resveratrol en la diferenciación osteogénica de las células madre mesenquimales de la médula ósea (BMSC) en ratones con osteoporosis. Se estableció un modelo de osteoporosis en ratones mediante inyección subcutánea de dexametasona y se trató con resveratrol administrado por sonda. In vivo e in vitro, utilizamos Western blot para detectar la expresión de proteínas y evaluamos la diferenciación osteogénica de BMSC detectando la expresión de proteínas relacionadas con la diferenciación osteogénica, la deposición de calcio, la actividad de ALP y el contenido de osteocalcina. El tratamiento con resveratrol aumentó significativamente el peso corporal de los ratones, el nivel sérico de Ca2+, 25(OH)D y osteocalcina, la proporción de peso óseo, el volumen óseo/ volumen total, el espesor trabecular, el número trabecular, el espaciado trabecular y el espesor cortical en ratones con osteoporosis. En BMSC de ratones con osteoporosis, el tratamiento con resveratrol aumentó significativamente la expresión de las proteínas Runx2, osterix (OSX) y osteocalcina (OCN), el nivel de deposición de calcio, la actividad de ALP y el contenido de osteocalcina. Además, el tratamiento con resveratrol también aumentó significativamente la expresión de SIRT1, p-PI3K/PI3K y p-AKT/AKT en BMSC de ratones con osteoporosis. In vitro, el resveratrol aumentó la expresión de las proteínas SIRT1, p-PI3K/PI3K y p- AKT/AKT, Runx2, OSX y OCN, el nivel de deposición de calcio, la actividad de ALP y el contenido de osteocalcina en BMSC de manera dependiente de la concentración, mientras que La caída de SIRT1 revirtió significativamente el efecto del resveratrol. El resveratrol puede atenuar la osteoporosis al promover la diferenciación osteogénica de las células madre mesenquimales de la médula ósea, y el mecanismo puede estar relacionado con la regulación de la vía SIRT1/PI3K/AKT.

Aislamiento de células mesenquimales del ligamento periodontal de premolares extraídos. Método simplificado / Isolation of periodontal ligament stem cells from extracted premolars. Simplified method

Resumen: El ligamento periodontal es un tejido conectivo fibroso, de origen ectomesenquimal que contiene una población de células troncales postnatales multipotenciales, con capacidad clonogénica y alto índice de proliferación. Se ha conseguido cultivar células troncales postnatales multipotenciales a través de diferentes métodos de extracción, con algunos problemas técnicos. Por esta razón, se compararon seis diferentes métodos a fin de mejorar el aislamiento de células primarias del ligamento periodontal. Se aislaron células troncales postnatales multipotenciales a partir de 36 premolares sanos, que se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (BioWest) completo (adicionado con L-glutamina, 10% de suero fetal bovino y 1% de antibiótico) y en condiciones estándares de cultivo. Se realizaron los ensayos para proliferación celular mediante la técnica de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difeniltetrazolio, migración celular a través de la prueba de lesión del cultivo, y se evaluó su diferenciación osteogénica. Los cultivos realizados por triplicado con cada una de las técnicas publicadas, nos condujo a obtener una población mínima de células que fueron susceptibles a contaminarse. Se realizó con el «método simplificado¼: por digestión enzimática y cultivo de explantos, con las células troncales postnatales multipotenciales obtenidas se observó una proliferación durante 14 días en condiciones estándares de cultivo ascendente, en las pruebas de migración las células troncales postnatales multipotenciales cubrieron totalmente la superficie lesionada a las 72 horas, se observó expresión positiva de CD90 en más del 80% de las células; expresión positiva a CD73 en un 70%, CD105 en un 60% y vimentina en un 90% de la población, así como un marcaje negativo a CD11b y CD45. Se observó una diferenciación osteogénica positiva a los 14 días mediante la expresión positiva a RUNX2 en al menos el 15% de las células y a osteocalcina en un 90%, así como las pruebas positivas a rojo de alizarina. Con los resultados obtenidos, podemos afirmar que el método simplificado permite aislar una población de células mesenquimales, que se pueden obtener a partir de premolares sanos extraídos.

Abstract: Periodontal ligament is a fibrous connective tissue of ectomesenchymal origin which contains a multipotent postnatal stem cells population with clonogenic capacity and high proliferation index. Multipotent postnatal stem cells population culture has been achieved through several extraction methods, nevertheless some technical problems have been encountered. For this reason, in the present study, 6 different methods were compared so as to improve isolation of primary periodontal ligament cells. Multipotent postnatal stem cells population were isolated from 36 healthy premolars, which were then cultured in complete Dulbecco m odified Eagle medium (BioWest) (added with L-glutamine, 10% fetal bovine serum and 1% antibiotic), in standard culture conditions. Assays for cell proliferation were conducted with 3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium technique as well as cell migration through crop injury test, after which osteogenic differentiation was assessed. Cultures were performed in triplicate with each of the published techniques; thus we were able to obtain a minimum population of cells susceptible to contamination. The «simplifled method¼ was conducted through explant enzymatic digestion and culture: with obtained multipotent postnatal stem cells population, a 14 day proliferation was observed in standard conditions of ascendant culture; in migration tests, multipotent postnatal stem cells population totally covered injured surfaces after 72 hours. CD90 positive expression was observed in over 80% of all cells; CD73 positive expression was found in 70% of cells, CD105 in 60% and vimentin in 90% of the population, as well as negative marking to CD11b and CD45. Positive osteogenic differentiation was observed after 14 days, through positive expression to RUNX2 in at least 15% of cells, and to osteocalcin in 90% as well as positive test to alizarin red. Based on obtained results we were able to affirm that the simplified method allows to isolate a population of mesenchymal cells, which might be obtained from extracted healthy premolars.

Aislamiento, caaacterización y potencial de difrenciación de células madre messenquimales caninas derivadas de tejido adiposo / Islation, characcterization and poential differentiation of caninne mesenchymal stem cells derived from adipose tissue

Se caracterizaron células obtenidas del tejido adiposo subcutáneo de caninos para demostrar su naturaleza de células madre mesenquimales (ad-MSCs). Las células se cultivaron y expandieron bajo condiciones in vitro. Se determinó la presencia de marcadores de superficie CD73, CD90 y CD105 por citometría de flujo y PCR en tiempo real, siendo idéntico el perfil de expresión obtenido al reportado en células madre mesenquimales humanas. Se demostró su potencial de diferenciación mediante análisis de expresión génica por PCR en tiempo real luego de inducirlas a procesos de diferenciación osteogénica y adipogénica. La capacidad de diferenciación osteogénica se evidenció a través de la expresión de genes de tejido óseo (colágeno tipo I y osteonectina) en una cinética de expresión concordante con los eventos moleculares y celulares del desarrollo óseo in vivo. El potencial adipogénico se evaluó por la formación de vacuolas lipídicas intracelulares y la expresión del gen de lipoprotein-lipasa, acorde con el proceso in vivo. Se concluye que las células mesenquimales obtenidas del tejido adiposo de caninos cumplen los criterios morfológicos, de expresión de marcadores de superficie específicos y de capacidad de diferenciación mesodérmica, confirmando su naturaleza de células madre mesenquimales. Los resultados del presente trabajo indicaron que las ad-MSCs de los caninos son un excelente modelo preclínico para el desarrollo de aplicaciones en medicina regenerativa, tanto en medicina veterinaria, como en medicina humana.

Cells obtained from the canine subcutaneous adipose tissue were characterized to demonstrate the nature of mesenchymal stem cells (adMSCs). The cells were cultured and expanded in vitro conditions. The presence of the surface markers CD73, CD90 and CD105 by flow cytometry and real time PCR was determined. The expression profile is identical to that reported in human mesenchymal stem cells. The differentiation potential was demonstrated by gene expression by real time PCR after induction osteogenic and adipogenic. Osteogenic differentiation was evidenced by the expression of genes of bone tissue (type I collagen and osteonectin) in expression kinetics consistent with the molecular and cellular events of bone development in vivo. In the adipogenic differentiation, were the formation of intracellular lipid vacuoles and expression of lipoprotein lipase gene (LPS), according to the in vivo process. We conclude that mesenchymal, cells derived from adipose tissue of dog, meet the morphological criteria, expression of specific surface markers and mesodermal differentiation capacity, confirming the nature of mesenchymal stem cells. The canine mesenchymal stem cells are an excellent preclinical model for developing applications in regenerative medicine that can be used both in veterinary and human medicine.

Carga mecánica oomo regulador de la osteogénesis en células madre mesenquimales humaaas / Mechanicl stresss as osteogenesis regulator in human mesenchymal stem cells / Carga mecânic coomo regulador da osteogênese em célulastronco mesenquimais humanas

El papel de la estimulación mecánica en la diferenciación de las células madre mesenquimales humanas (CMMHs) es una alternativa terapéutica para aplicaciones en ingeniería tisular. Este estudio evaluó el efecto de cargas mecánicas sobre la diferenciación de las CMMHs, y los mecanismos celulares que intervienen en el proceso de mecanotransducción. Las CMMHs se sembraron en frascos de cultivo de 75cm2 y fueron expuestas a tensión uniaxial de deformación de 500, 1000, 1500 y 2000 micro strains (με), con una intensidad de 9 ciclos/minuto por 3 horas durante 4 días consecutivos. Se evaluó la actividad transcripcional de los factores de transcripción Runx2 y Sox9 y de los genes de Osteocalcina (OC), Colágeno tipo 1 (Col1) y Fosfatasa Alcalina (ALP). Después de la exposición al estímulo, los marcadores osteogénicos Col1, OC, y ALP se expresaron temporalmente; y los factores de transcripción Runx2 y Sox9 disminuyeron la expresión con respecto a las células de grupo control (sin estímulo), sugiriendo que el estímulo mecánico indujo la diferenciación de las células CMMHs a linaje osteoblástico. La identificación de los genes que traducen los estímulos mecánicos en las CMMHs y modulan la diferenciación osteogénica, tienen proyección directa en medicina regenerativa a través del desarrollo y perfeccionamiento del enfoque de ingeniería de tejidos funcionales.

The role of mechanical stimulation for mesenchymal stem cells (MSCs) differentiation is a therapeutic alternative for applications in tissue engineering. The aim of this study was to evaluate the effect of mechanical strain on the differentiation and cellular mechanisms of mechanotransduction in MSCs. The cells were seeded in 75cm2 culture flasks and then exposed to uniaxial mechanical tensile strain of 500, 1000, 1500 and 2000 micro strains (με), 9 cycles / minute during 3 hours for 4 consecutive days. Runx2 and Sox9 transcription factors andOsteocalcin (OC), Collagen Type 1 (Col1) and Alkaline Phosphatase (ALP) gene expression was ascertained. After exposure to mechanical strain, osteogenic marker genes Col1, OC, and ALP were expressed temporally, while Runx2 and Sox9 transcription factors expression decreased, compared with control cells without stimulation, suggesting that mechanical stimulus induced differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblast lineage. Identification of genes that translate mechanical stimuli in MSCs and modulate osteogenic differentiation hasimportant implications in regenerative medicine as an approach to functional tissue engineering.

O papel da estimulação mecânica na diferenciação das célulastronco mesenquimais humanas (CMMHs) é uma alternativa terapêutica para aplicações em engenharia tissular. Este estudo avaliou o efeito de cargas mecânicas sobre a diferenciação das CMMHs, e os mecanismos celulares que intervém no processo de Mecanotransdução. As CMMHs foram cultivadas em frascos de cultivo de 75cm2 e foram expostas a tensão uniaxial de deformação de 500, 1000, 1500 e 2000 micro strains (με), com uma intensidade de 9 ciclos/minuto por 3 horas durante 4 dias consecutivos. Foi avaliada a atividade transcricional dos fatores de transcrição Runx2 e Sox9 e dos genes de Osteocalcina (OC), Colágeno tipo 1 (Col1) e Fosfatase Alcalina (ALP). Depois da exposição ao estímulo, os marcadores osteogênicos Col1, OC, e ALP foram expressos temporariamente; e os fatores de transcrição Runx2 e Sox9 diminuíram a expressão em comparação com as células do grupo controle (sem estímulo), sugerindo que o estímulo mecânico induziu a diferenciação das células CMMHs à linhagem osteoblástica. A identificação dos genes que traduzem os estímulos mecânicos nas CMMHs e modulam a diferenciação osteogênica, têm projeção direta na medicina regenerativa através do desenvolvimento e aperfeiçoamento do enfoque de engenharia de tecidos funcionais.

OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE DEL TEJIDO ADIPOSO Y SU POTENCIAL DE DIFERENCIACIÓN OSTEOGÉNICO / ADIPOSE TISSUE DERIVED MESENCHYMAL STEM CELLS, ISOLATION AND DIFFERENTIATION INTO THE OSTEOGENIC LINEAGE

El tejido adiposo es una de las principales fuentes de células madre de fácil obtención y con alto potencial de diferenciación hacia linajes celulares especializados. Con el objetivo de estandarizar la obtención de estas células y dirigir su diferenciación hacia el linaje osteogénico, se utilizó tejido adiposo procedente de liposucción y de abdominoplastia. Se aplicaron métodos de disgregación mecánica y enzimática del tejido para obtener las células. La morfología celular obtenida fue similar a fibroblastos y a células madre reportadas por otros autores. Se encontró una mayor eficiencia en el procesamiento del lipoaspirado en comparación con el tejido resultante de abdominoplastia, y la disgregación enzimática del tejido permitió una mayor liberación de células y una temprana adhesión al plato de cultivo. La inducción de las células madre derivadas de lipoaspirado hacia el linaje osteogénico permitió la observación, mediante tinción con alizarina roja S, de depósitos de calcio en la matriz extracelular en las células bajo condiciones de diferenciación, pero no en aquellas sin suplementos osteogénicos. Se obtuvieron cultivos de células madre derivadas de lipoaspirado con capacidad de diferenciación hacia el linaje osteogénico, a través de inducción controlada, que podrían ser utilizadas en la ingeniería de tejido óseo.

Adipose tissue is one of the main sources of stem cells readily available and with a high potential to differentiate into specific mesenchymal and non-mesenchymal lineages. Therefore, to standardize the collection of these cells, adipose tissue from surgical liposuctions and abdominoplasty was used. Methods of enzymatic and mechanical digestion were used to release the cells. With regard to cell morphology, the cells displayed a fibroblast-like spindleshaped morphology as cited by other authors. There was a higher efficiency in processing tissue from liposuctions compared with tissue from abdominoplasty. Likewise, the enzymatic digestion allowed faster initial cell adhesion than the mechanical digestion. Finally, calcium deposits were observed by alizarin red staining in cultures under osteogenic conditions, but were absent in cultures lacking osteogenic supplements. In conclusion, isolated adiposedderived stem cells were capable of osteogenic differentiation and therefore with potential applications in bone tissue engineering.