Análisis de los niveles de ácidos orgánicos en orina de la primera infancia y recién nacidos: un estudio de cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas con evaluación de rangos de referencia / Analysis of urinary organic acid levels in early childhood and newborns: a gas chromatography-mass spectrometry study with evaluation of reference ranges / Análise dos níveis de ácidos orgânicos na urina da primeira infância e dos recém-nascidos: um estudo por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa com avaliação de intervalos de referência

Resumen El análisis de los ácidos orgánicos urinarios juega un papel crucial en el diagnóstico y seguimiento de pacientes con trastornos metabólicos congénitos. La falta de datos completos, las variaciones en los hábitos alimentarios entre países y el aumento del consumo de alimentos procesados subrayan la necesidad de realizar investigaciones actualizadas. Con el fin de establecer los intervalos de confianza y medianas de ácidos orgánicos urinarios se evaluaron mediante cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas, 125 muestras de orina de pacientes sanos, con edades comprendidas entre 2 días y 13 años. Los resultados fueron analizados teniendo en cuenta el grupo etario, y evidenciaron que las concentraciones de la mayoría de los ácidos orgánicos urinarios varían de acuerdo a la edad, lo que enfatiza la importancia de los valores de referencia emparejados con la edad para interpretar los datos de los pacientes. Existen pocos informes en esta área; sin embargo, la comparación de estos resultados con los valores de referencia informados por otros trabajos muestra una concordancia razonable y las pocas disparidades podrían atribuirse a factores genéticos o influencias dietéticas. Se presentan resultados e interpretaciones de niños previamente diagnosticados con trastornos metabólicos y otras afecciones, lo que confirma la confiabilidad de nuestros datos y métodos analíticos. Este estudio proporciona datos de referencia esenciales para los profesionales clínicos, destaca la importancia de los valores de referencia específicos de la edad para diagnosticar y tratar con precisión a pacientes con trastornos metabólicos y sirve como recurso fundamental para futuras investigaciones en este campo.

Abstract Analysis of urinary organic acids plays a crucial role in the diagnosis and monitoring of patients with congenital metabolic disorders. The lack of complete data, variations in dietary habits between countries, and increasing consumption of processed foods highlight the need for up-to-date research. In order to establish the confidence intervals and medians of urinary organic acids, 125 urine samples from healthy patients, aged between 2 days and 13 years, were evaluated by gas chromatography coupled to mass spectrometry. The results were analysed taking into account the age group, showing that the concentrations of most urinary organic acids vary according to age, which emphasises the importance of paired age reference values to interpret patient data. There are few reports in this area; however, comparing our results with those reference values reported by other papers demonstrates reasonable agreement, and minor disparities could be attributed to genetic factors or dietary influences. Results and interpretations from children previously diagnosed with metabolic disorders and other conditions are presented, confirming the reliability of our data and analytical methods. This study provides essential reference data for clinicians, highlighting the importance of age-specific reference values to accurately diagnose and treat patients with metabolic disorders and serves as a critical resource for future research in this field.

Resumo A análise dos ácidos orgânicos urinários desempenha um papel crucial no diagnóstico e monitoramento de pacientes com distúrbios metabólicos congênitos. A falta de dados completos, as variações nos hábitos alimentares entre países e o aumento do consumo de alimentos processados destacam a necessidade de realizar pesquisas atualizadas. Para estabelecer os intervalos de confiança e medianas de ácidos orgânicos urinários, 125 amostras de urina de pacientes saudáveis, com idades entre 2 dias e 13 anos, foram avaliadas por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa. Os resultados foram analisados levando em consideração o grupo etário, evidenciando que as concentrações da maioria dos ácidos orgânicos urinários variam de acordo com a idade, o que destaca a importância dos valores de referência pareados com a idade para interpretar os dados dos pacientes. Há poucos relatos nesta área; no entanto, a comparação destes resultados com os valores de referência informados por outros trabalhos demonstra uma concordância razoável, e as poucas disparidades poderiam ser atribuídas a fatores genéticos ou influências dietéticas. São apresentados resultados e interpretações de crianças previamente diagnosticadas com distúrbios metabólicos e outras condições, o que confirma a confiabilidade de nossos dados e métodos analíticos. Este estudo fornece dados de referência essenciais para profissionais clínicos, enfatizando a importância dos valores de referência específicos da idade para diagnosticar e tratar com precisão pacientes com distúrbios metabólicos, e serve como recurso fundamental para futuras pesquisas nesse campo.

Influence of different opacities and layering technique of nanotechnology composite resins regarding the wavelength and fluorescence intensity: in vitro study / Influencia de diferentes opacidades y la técnica de estratificación de resinas compuestas de nanotecnología en la longitud de onda e intensidad de fluorescencia: estudio in vitro

Objective: To evaluate the influence of opacity and the layering technique on the fluorescence of different composite resins. Materials and Methods: Two opacities (enamel and dentin) and the layering technique (enamel + dentin) of the composite resins: Filtek® Z350 and Palfique LX5 were evaluated in vitro. Composite resin discs were fabricated using a preformed matrix of 10 mm diameter and 0.5 mm thick for the single opacity groups and 10 mm thick for the layering technique groups, using 2 layers of 0.5 mm thickness of each opacity (n = 5). Specimens were analyzed using the Raman spectroscopy method. Data were analyzed using the Kruskall-wallis and Mann-Whitney U tests. Results: When evaluating the intensity of fluorescence, no statistically significant difference was found when comparing the layering technique and enamel opacity (p2> 0.05) and an increase in the dentin opacity value for both brands of composite resin. Regarding wavelength, no statistically significant difference was found when comparing the layering technique with enamel opacity and dentin opacity for both Filtek® Z350 and Palfique LX5® composite resins (p2 > 0.05). Conclusions: The fluorescence intensity of the layering technique is similar to enamel opacity for both composite resins. Likewise, the wavelength of the layering technique is similar to the enamel opacity and dentin opacity for both brands.

Objetive: Evaluar la influencia de la opacidad y de la técnica de estratificación en la fluorescencia de diferentes resinas compuestas. Materiales y Métodos: Se evaluó in vitro 2 opacidades (Esmalte y Dentina) y la técnica de estratificación (Esmalte + Dentina) de las resinas compuestas: Filtek® Z350 y Palfique LX5. Se fabricaron discos de resina compuesta, utilizando una matriz preformada de 10 mm de diámetro y 0,5 mm de grosor para los grupos de opacidad única y 10 mm de grosor para los grupos de técnica estratificada, utilizando 2 capas de 0,5 mm de cada opacidad (n = 5). Los especímenes se analizaron mediante el método de Espectroscopía Raman. Los datos se analizaron utilizando la prueba de Kruskall-wallis y Prueba U de Mann Whitney. Resultado: Al evaluar la intensidad de fluorescencia no se encontró diferencia estadísticamente significativa entre los pares: Técnica estratificada versus Opacidad Esmalte para ambas marcas de resina compuesta Filtek® Z350 y para Palfique LX5® (p2 > 0,05). Para longitud de onda no se encontró diferencia estadísticamente significativa entre los pares: Técnica estratificada versus Opacidad Esmalte y Técnica estratificada VS Opacidad Dentina para ambas resinas compuesta Filtek® Z350 y Palfique LX5® (p2> 0,05). Conclusión: La intensidad de fluorescencia de la técnica estratificada es similar a la opacidad Esmalte para ambas resinas compuestas. De igual manera la longitud de onda de la técnica estratificada es similar a la opacidad Esmalte y opacidad Dentina para ambas marcas.

Análise proteômica da saliva de usuários de cigarro eletrônico / Proteomic analysis of electronic cigarette users' saliva

O cigarro eletrônico, também conhecido como e-cig, tem sido amplamente utilizado nos últimos anos, principalmente pela população mais jovem. Substâncias citotóxicas e carcinogênicas podem estar presentes em sua composição, no entanto, pouco se sabe sobre os riscos do seu uso. O objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil proteico da saliva de usuários de cigarro eletrônico por meio de estudo proteômico e as possíveis alterações salivares desses indivíduos. Para tanto, os participantes foram divididos em dois grupos: Grupo Cigarro Eletrônico (GCE), composto por 25 vaporizadores regulares e exclusivos de e-cig, e Grupo Controle (GCO), constituído por 25 indivíduos não fumantes e não vaporizadores de e-cig, pareados por sexo e idade ao GCE. Todos os participantes foram submetidos a exame clínico e coleta de saliva não estimulada para verificação da sialometria e avaliação do proteoma salivar. As amostras foram aliquotadas e submetidas às seguintes análises: viscosidade salivar, pH, capacidade tampão e mensuração da cotinina salivar realizada por meio do teste imunoenzimático (ELISA) utilizando Cotinine Enzyme Immunoassay Kit (Salimetrics). O perfil etílico dos pacientes foi avaliado por meio do teste AUDIT (Alcohol Use Disorders Identification Test) e por perguntas referentes ao consumo de álcool. Já o perfil de consumo do e-cig foi traçado por meio de perguntas referentes ao uso dos dispositivos e teste de concentração de monóxido de carbono no ar expirado. A análise proteômica foi realizada utilizando a metodologia shotgun e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS). Os resultados obtidos, uma vez que não possuíam distribuição normal, foram submetidos ao teste de Mann Whitney. Foi observada maior concentração de CO exalado, maior concentração salivar de cotinina, maior pontuação no AUDIT, menor viscosidade salivar e resultado desfavorável na oximetria. Em relação ao proteoma salivar, 48 proteínas foram específicas do GCE, sendo que 3 das proteínas desse conjunto estão diferencialmente expressas nesse grupo. Conclui-se que os usuários de cigarro eletrônico apresentam maiores índices de consumo de bebida alcoólica e uma menor viscosidade salivar, alterações importantes na capacidade respiratória demonstrada pelo aumento da concentração de CO no ar expirado e diminuição da oximetria e altos níveis de cotinina presentes na saliva. Além disso, a maior abundância de proteínas, como Glutationa S-transferase P, Cadeia J de imunoglobulina e Acetína desidrogenase, sugerem uma resposta do organismo ao aumento do estresse oxidativo, presença de componentes inflamatórios e alterações microbiológicas salivares que podem favorecer o desenvolvimento de condições patológicas futuras.(AU)

The electronic cigarette, also known as e-cig, has been widely used in recent years, especially by younger populations. Cytotoxic and carcinogenic substances may be present in its composition; however, little is known about the risks of its use. The aim of this study was to evaluate the protein profile of saliva from electronic cigarette users through proteomic analysis and the possible salivary alterations in these individuals. For this purpose, participants were divided into two groups: the Electronic Cigarette Group (ECG), composed of 25 regular and exclusive e-cig users, and the Control Group (CG), consisting of 25 non-smokers and non-e-cig users, matched by sex and age to the ECG. All participants underwent clinical examination and unstimulated saliva collection for salivary flow rate measurement and evaluation of salivary proteome. The samples were aliquoted and subjected to the following analyses: salivary viscosity, pH, buffer capacity, and measurement of salivary cotinine performed using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Cotinine Enzyme Immunoassay Kit (Salimetrics). The participants' alcohol consumption profile was assessed using the Alcohol Use Disorders Identification Test (AUDIT) and questions related to alcohol consumption. The e-cig consumption profile was traced through questions related to device usage and testing for carbon monoxide concentration in expired air. Proteomic analysis was performed using shotgun methodology and liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS). Since the obtained results did not follow a normal distribution, they were subjected to the Mann-Whitney test. A higher concentration of exhaled CO was observed, along with a higher salivary concentration of cotinine, higher scores on the AUDIT, lower salivary viscosity, and an unfavorable result on oximetry. Regarding the salivary proteome, 48 proteins were specific to GCE, with 3 of these proteins being differentially expressed in this group. It is concluded that electronic cigarette users have higher rates of alcohol consumption and lower salivary viscosity, important alterations in respiratory capacity demonstrated by increased CO concentration in expired air and decreased oximetry, and high levels cotinine present in saliva. Furthermore, the higher abundance of proteins such as Glutathione S-transferase P, Immunoglobulin J chain, and Acetyl-CoA dehydrogenase, suggest an organism response to increased oxidative stress, presence of inflammatory components, and salivary microbiological alterations that may favor the development of future pathological conditions (AU)

Fusariosis in cancer patients: 13 case series report and literature review / Fusariosis en pacientes con cáncer: serie de 13 casos y revisión de la literatura

The fusariosis is an opportunistic mycosis caused by Fusarium spp. Its clinical presentation depends on the immunological status of the host, especially in patients with hematooncological diseases, whose manifestations vary from localized to invasive fungal infections. Skin or blood culture helps to guide combined antifungal treatment with amphotericin B and voriconazole. Here, we present 13 cases in a period of eleven years of patients with cancer who developed disseminated fusariosis and their outcomes, together with a review of the related literature. In this series of cases, mortality was 61.5 % (8/13), despite the use of the antifungal. Out of the 13 cases, 11 had hematological neoplasia and 2 solid neoplasia. The most determinant risk factor was profound neutropenia. Skin involvement and positive blood cultures in most cases allowed combined treatment prescription. Persistent febrile neutropenia associated with skin lesions, onychomycosis, nodules, or lung masses lead to suspicion of Fusarium spp. fungal invasive infection. The aim of this series of cases is to remind healthcare professionals that oncological patients with deep and persistent febrile neutropenia can develop fusariosis.

La fusariosis es una micosis oportunista producida por Fusarium spp. Su presentación clínica depende del estado inmunológico del huésped, especialmente, el de aquellos con enfermedades hematooncológicas, cuyas manifestaciones varían desde formas localizadas hasta infección fúngica invasora. El cultivo de piel o de sangre permite orientar el tratamiento antifúngico combinado con anfotericina B y voriconazol. Se presentan 13 casos de pacientes con cáncer en un periodo de once años que desarrollaron fusariosis diseminada; asimismo, se hizo con una revisión extensa de la literatura. En esta serie de casos, la mortalidad fue del 61,5 % (8/13), a pesar del uso del antifúngico. De los 13 pacientes, 11 tenían neoplasia hematológica y 2 neoplasia sólida. El factor de riesgo más importante fue la neutropenia profunda. El compromiso de la piel y los hemocultivos positivos facilitaron la prescripción del tratamiento combinado en la mayoría de los casos. La neutropenia febril persistente asociada a lesiones cutáneas, la onicomicosis, los nódulos o las masas pulmonares permitieron sospechar una infección fúngica invasora por Fusarium spp. El objetivo de la presentación de esta serie de casos es recordar el diagnóstico de fusariosis a la comunidad médica en contacto con pacientes oncológicos, con neutropenia febril profunda y persistentes.

Analysis of the distribution of microhardness, mineral, and organic content of human, bovine, and ovine teeth / Análisis de la distribución de microdureza, contenido mineral y orgánico de dientes humanos, bovinos y ovinos

Objetive. Human teeth have been commonly used for in vitro and in situ studies. Cu­rrently, other animals' teeth have been purposed for dental research to overcome human teeth' problematic availability. This study aimed to investigate the enamel and dentin from human, bovine, and ovine teeth concerning the microhardness, organic, and in­ organic contents via micro­Raman spectroscopy. Methods. Human, bovine, and ovine teeth were divided according to their type and age into seven groups: Ovine; Bovine­12 months; Bovine­24 months; Bovine­36 months; Bovine­48 months; Bovine­+60 months; Human (control). The enamel's microhardness (superficial and deep) and den­tin (superficial, middle, and deep) were analyzed. The calcium/phosphate ratio and am­ide contents were determined by micro­Raman spectroscopy. Results. Overall, the mi­crohardness of human enamel was superior to the other species. Dentin's microhardness was similar among groups. Ovine group showed lower values of calcium/phosphate ratio than human. Amide content was similar between bovine and human. The microhardness and calcium/phosphate ratio of enamel and dentin, respectively, decreased as the age of bovine teeth increased. Conclusions. Researchers must be aware and take into consider­ation the differences of ovine and bovine enamel compared to human enamel. Other al­ternatives that are more similar to the microhardness of human enamel should be sought. Bovine teeth of 12 and 24 months are suitable substitutes for dentin of human teeth. Researchers must also be aware of the age of the animals and specify it in the studies.

Objetivo. Los dientes humanos se han utilizado comúnmente para estudios in vitro e in situ. Actualmente, los dientes de otros animales se han destinado a la investiga­ción dental para superar la disponibilidad problemática de los dientes humanos. Este estudio tuvo como objetivo investigar el esmalte y la dentina de los dientes humanos, bovinos y ovinos en relación con la microdureza y los contenidos orgánicos e inor­gánicos a través de la espectroscopia micro­Raman. Métodos. Los dientes humanos, bovinos y ovinos se dividieron según su tipo y edad en siete grupos: Ovinos; Bovino­12 meses; Bovino­24 meses; Bovino­36 meses; Bovino­48 meses; Bovino­+60 meses; Hu­mano (control). Se analizó la microdureza del esmalte (superficial y profunda) y de la dentina (superficial, media y profunda). La relación calcio/fosfato y los contenidos de amida se determinaron mediante espectroscopía micro­Raman. Resultados. En general, la microdureza del esmalte humano fue superior a la de otras especies. La microdureza de la dentina fue similar entre los grupos. El grupo ovino mostró valores más bajos de la relación calcio/fosfato que el humano. El contenido de amida fue similar entre bovinos y humanos. La microdureza y la relación calcio/fosfato del esmalte y la dentina, respectiva­mente, disminuyeron a medida que aumentaba la edad de los dientes bovinos. Conclusiones. El esmalte de los dientes ovinos y bovinos no es un sustituto adecuado del de los dientes humanos. Se deben buscar otras alternativas que sean similares a la microdureza del esmalte humano. Sin embargo, los dientes bovinos de 12 y 24 meses son sustitutos adecuados de la dentina de los dientes humanos. Los investigadores deben conocer la edad de los animales y especificarla en los estudios.

Occurrence of clinical laminitis after adaptation to confinement: effects on morphology, density, and mineral composition of the hoof of Nellore cattle after finishing / Ocorrência de laminite clínica após adaptação ao confinamento: efeitos na morfologia, densidade e composição mineral do casco de bovinos Nelore após terminação

Laminitis is a disease that affects the dermis and epidermis of the bovine hoof, generating changes in the hoof capsule. This study evaluated the effects of clinical laminitis diagnosed after the adaptation phase to confinement on the morphology, density, and mineral composition of the hoof of Nellore cattle after finishing. The animals were separated in the first weeks of confinement into a sick group (SG), with clinical laminitis, and a healthy group (HG). SG animals had higher heel length, dorsal wall length, toe height, and diagonal hoof length (p<0.05) than healthy animals. The dermal laminae had similar measurements for thickness, length, and spacing between them between SG and HG. Animals with laminitis showed congestion, hemorrhage, and basement membrane irregularities on histology. Computed microtomography (µCT) revealed that the hoof density of sick animals is lower than healthy ones. According to the mineral composition by energy-dispersive X-ray fluorescence (ED-XRF) spectrometry, the hooves of animals with laminitis (SG) and healthy ones (HG) were not biochemically different. Therefore, the occurrence of clinical laminitis in Nellore cattle in the first weeks of confinement causes an increase in the morphometric parameters of the hoof capsule and a reduction in the density of the abaxial hoof wall evaluated after the finishing period. This disease does not promote changes in the histomorphometric parameters of the dermal laminae and the percentage of minerals in the abaxial hoof wall.

A laminite é uma doença que afeta a derme e epiderme do casco de bovinos gerando alterações no estojo córneo. O estudo avaliou os efeitos da laminite clínica diagnosticada após a fase de adaptação ao confinamento na morfologia, densidade e composição mineral do casco de bovinos da raça Nelore após terminação. Nas primeiras semanas de confinamento, os animais foram separados em um grupo doente (GD) com laminite clínica e em um grupo saudável (GS). Os animais do GD apresentaram maior comprimento de talão, comprimento da parede dorsal, altura da pinça e comprimento diagonal do casco (p<0,05) do que os saudáveis. As lâminas dérmicas tiveram medidas semelhantes para espessura, comprimento e espaçamento entre elas entre GD e GS. Animais doentes apresentaram congestão, hemorragia e irregularidades da membrana basal na histologia. A microtomografia computadorizada (µCT) revelou que a densidade do casco de animais doentes é menor do que o saudável. Para a composição mineral por meio da espectrometria de fluorescência de raio-X por dispersão de energia (ED-XRF), o casco dos animais doentes (GD) e dos saudáveis (GS), não se mostraram diferentes bioquimicamente. Conclui-se que a ocorrência de laminite clínica em bovinos da raça Nelore nas primeiras semanas de confinamento ocasiona aumento de parâmetros morfométricos do estojo córneo e redução da densidade da parede abaxial do casco, avaliados após o período de terminação. Essa enfermidade não promove modificações nos parâmetros histomorfométricos das lâminas dérmicas e na porcentagem de minerais da parede abaxial do casco.

Microbial diversity in artisanal cheese produced and commercialized in Vale do Taquari in southern Brazil / Diversidade microbiana encontrada em queijos artesanais produzidos e comercializados no Vale do Taquari no sul do Brasil

Researchers have been utilizing matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) to identify bacteria and fungi directly from isolates obtained on culture plates; the resulting mass spectrum is then compared with spectra stored in the instrument software. Hence, a fast analytical response is obtained, and the more spectra are known to compare, the safer and more reliable the interpretation of the method will be. Thus, this study sought to identify the diversity of strains found in 10 samples of artisan cheese produced and commercialized in Vale do Taquari (Rio Grande do Sul State, Brazil) using MALDI-TOF MS. From the analyzed cheese, 22 strains were identified at the species level; one sample presented the pathogen Staphylococcus aureus, two showed the presence of lactic acid bacteria (Lactococcus lactis), and the vast majority (68.18%) of strains were composed of species of the Enterobacteriaceae family, with the prevalence of the genera Escherichia, Enterobacter, and Klebsiella. Escherichia coli was present in 50% of the samples analyzed. This demonstrates the need for greater control during all stages of artisanal cheese production and evaluation of the raw material, including safe practices during milking, so that the product meets the identity and quality parameters suitable for human consumption.

MALDI-TOF MS vendo sendo utilizado em laboratórios para identificar bactérias e fungos diretamente de isolados obtidos em placas de cultura. O espectro de massa resultante é então comparado com espectros armazenados no software do equipamento. Assim, obtém-se uma resposta analítica rápida, sendo que, quanto mais espectros forem conhecidos para comparar, mais seguro e confiável será a interpretação do método. Desta maneira, o presente trabalho teve por objetivo, identificar por MALDI-TOF MS, a diversidade de cepas encontrados em 10 amostras de queijos artesanais produzidos e comercializados no Vale do Taquari, Rio Grande do Sul, Brasil. Dos queijos analisados, 22 cepas foram identificadas a nível de espécie, sendo uma (1) amostra apresentou o patógeno Staphylococcus aureus, duas a presença da bactéria ácido láctica (Lactococcus lactis) e a grande maioria (68,18%) das cepas era composta por espécies da família Enterobacteriaceae, com prevalência dos gêneros Escherichia, Enterobacter e Klebsiella. E. coli estava presente em 50% das amostras analisadas. Isso demonstra a necessidade de um maior controle durante todas as etapas de produção do queijo artesanal, bem como a avaliação da matéria-prima, incluindo práticas seguras durante a ordenha para que o produto atenda aos parâmetros de identidade e qualidade, sendo apto ao consumo humano.

Geotricosis: fungemia en paciente con leucemia linfoblástica aguda / Geotrichosis: fungemia in a patient with acute lymphoblastic leukemia

La fungemia por Geotrichum spp. es poco frecuente y altamente letal. En el Instituto Nacional de Cancerología de Bogotá solo se han reportado dos casos: uno entre el 2001 y el 2007, y el otro entre el 2012 y el 2018. Este tipo de infección es más común en pacientes con algún grado de compromiso del sistema inmunitario, por lo que puede presentarse en pacientes con neoplasias hematológicas malignas. Se presenta el caso de un hombre de 27 años con recaída de leucemia linfoblástica aguda, que ingresó con poliartralgias de cinco días de duración. También cursaba con neutropenia febril, celulitis sin abscesos y bacteriemia por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina para lo cual recibió terapia con oxacilina y cefepime. Sin embargo, persistía la neutropenia febril por lo que se sospechó una infección fúngica invasora. Se tomó un nuevo set de hemocultivos y se inició tratamiento antifúngico. En los hemocultivos se identificaron artroconidias y mediante espectrometría de masas por láser de matriz asistida de ionización-desorción se confirmó la presencia de Geotrichum spp. Se ajustó el tratamiento antifúngico con deoxicolato de anfotericina B por 14 días y voriconazol por cuatro semanas. Luego de una estancia prolongada se le dio de alta. Aunque la incidencia de la fungemia por Geotrichum spp. es baja, en pacientes con neoplasias hematológicas malignas debe considerarse en el contexto de una neutropenia febril que es persistente a pesar del tratamiento antimicrobiano de amplio espectro. La identificación de los agentes causantes de fungemias con herramientas de proteómica, como la espectrometría de masas mencionada, permite ajustar el tratamiento dirigido y reducir las complicaciones, la estancia hospitalaria y la mortalidad.

Fungemia caused by Geotrichum spp. is rare and highly lethal. The Instituto Nacional de Cancerología in Bogotá reported just two cases: one in the period 2001-2007 and the other in 2012-2018. This type of infection is more common in any kind of immunocompromised patients, so it can occur in those with hematological malignancies. Here we present the case of a 27-year-old man, diagnosed with acute lymphoblastic leukemia in relapse and admitted with polyarthralgia for five days, febrile neutropenia, non- abscessed cellulitis, and bacteremia due to methicillin-sensitive Staphylococcus aureus. The patient received therapy with oxacillin and cefepime, but the febrile neutropenia persisted. A new set of blood cultures was taken, and antifungal treatment was started because of the suspicion of invasive fungal infection. Arthroconidia were identified in blood cultures and Geotrichum spp. was confirmed using matrix-assisted laser desorption-ionization mass spectrometry. The antifungal treatment was adjusted with amphotericin B deoxycholate for 14 days and voriconazole for four weeks, and after a prolonged stay, the patient was discharged. Although the incidence of fungemia caused by Geotrichum spp. is low, it must be considered in patients with hematological malignancies and persistent febrile neutropenia despite the broadspectrum antimicrobial treatment. The confirmation of fungemia causing agents, with proteomic tools such as the mentioned mass spectrometry, allows treatment adjustment and decreases complications, hospital stay, and mortality.

Fusariosis en pacientes con cáncer: serie de 13 casos y revisión de la literatura / Fusariosis in cancer patients: 13 case series report and literature review

La fusariosis es una micosis oportunista producida por Fusarium spp. Su presentación clínica depende del estado inmunológico del huésped, especialmente, el de aquellos con enfermedades hematooncológicas, cuyas manifestaciones varían desde formas localizadas hasta infección fúngica invasora. El cultivo de piel o de sangre permite orientar el tratamiento antifúngico combinado con anfotericina B y voriconazol. Se presentan 13 casos de pacientes con cáncer en un periodo de once años que desarrollaron fusariosis diseminada; asimismo, se hizo con una revisión extensa de la literatura. En esta serie de casos, la mortalidad fue del 61,5 % (8/13), a pesar del uso del antifúngico. De los 13 pacientes, 11 tenían neoplasia hematológica y 2 neoplasia sólida. El factor de riesgo más importante fue la neutropenia profunda. El compromiso de la piel y los hemocultivos positivos facilitaron la prescripción del tratamiento combinado en la mayoría de los casos. La neutropenia febril persistente asociada a lesiones cutáneas, la onicomicosis, los nódulos o las masas pulmonares permitieron sospechar una infección fúngica invasora por Fusarium spp. El objetivo de la presentación de esta serie de casos es recordar el diagnóstico de fusariosis a la comunidad médica en contacto con pacientes oncológicos, con neutropenia febril profunda y persistentes.

The fusariosis is an opportunistic mycosis caused by Fusarium spp. Its clinical presentation depends on the immunological status of the host, especially in patients with hemato-oncological diseases, whose manifestations vary from localized to invasive fungal infections. Skin or blood culture helps to guide combined antifungal treatment with amphotericin B and voriconazole. Here, we present 13 cases in a period of eleven years of patients with cancer who developed disseminated fusariosis and their outcomes, together with a review of the related literature. In this series of cases, mortality was 61.5 % (8/13), despite the use of the antifungal. Out of the 13 cases, 11 had hematological neoplasia and 2 solid neoplasia. The most determinant risk factor was profound neutropenia. Skin involvement and positive blood cultures in most cases allowed combined treatment prescription. Persistent febrile neutropenia associated with skin lesions, onychomycosis, nodules, or lung masses lead to suspicion of Fusarium spp. fungal invasive infection. The aim of this series of cases is to remind healthcare professionals that oncological patients with deep and persistent febrile neutropenia can develop fusariosis.

Diagnóstico de amiloidosis renal AA mediante espectrometría de masas en un paciente con proceso inflamatorio crónico grave abdominal

Introducción la amiloidosis es una enfermedad rara, producto del plegamiento y depósito normal de proteínas en tejidos y órganos. Esta enfermedad puede tener un compromiso renal que se manifiesta con síndrome nefrótico y deterioro de la función renal y su etiología puede estar asociada a amiloidosis con compromiso sistémico, siendo la amiloidosis AL y la amiloidosis AA las más frecuentes, esta última está asociada a inflamación crónica grave de origen infecciosa o autoinmune. Para el diagnóstico es fundamental el estudio sistémico multidisciplinario (hematológico, cardiaco, autoinmune, infeccioso y neoplásico), y cuando hay compromiso renal: la biopsia con estudio completo de microscopía de luz, tinciones especiales incluyendo rojo congo, inmunofluorescencia y microscopía electrónica. Cuando no se logra establecer la causa, la espectrometría de masas es una ayuda crucial para el diagnóstico específico. Objetivo se presenta el caso de un paciente con un proceso inflamatorio crónico grave abdominal que evolucionó a síndrome nefrótico por amiloidosis AA, donde la espectrometría de masas ayudó a aclarar el diagnóstico. Presentación del caso se presenta el caso de un paciente con un proceso inflamatorio crónico grave abdominal que evolucionó a síndrome nefrótico por amiloidosis AA, donde la espectrometría de masas ayudó a aclarar el diagnóstico Discusión y conclusiones se considera que la espectrometría de masas es un estudio diagnóstico muy importante para establecer el diagnóstico etiológico de la amiloidosis cuando otros métodos no han logrado establecerlo.

Introduction Amyloidosis is a rare disease, resulting from the accumulation and deposition of insoluble proteins in tissues or organs. This disease may involve the kidney, resulting in nephrotic syndrome and renal failure. The amyloidosis has been associated with systemic involvement, with AL amyloidosis and AA amyloidosis being the most common. The last is associated with various inflammatory disorders as chronic infections and autoimmune diseases. A multidisciplinary approach is required to the diagnosis (hematologic, cardiac, autoimmune, infectious, neoplastic) and in cases of renal involvement, a kidney biopsy with complete study of light microscopy, special stains including congo red, immunofluorescence, electron microscopy is essential for diagnosis. In cases where the cause cannot be stablished, mass spectrometry is practical tool to the identification of the correct type of amyloidosis. Purpose Here, we present a patient with a chronic and severe abdominal inflammatory process that progressed to a nephrotic syndrome due to AA amyloidosis, in which mass spectrometry helped to clarify the diagnosis. Case presentation Here, we present a patient with a chronic and severe abdominal inflammatory process that progressed to a nephrotic syndrome due to AA amyloidosis, in which mass spectrometry helped to clarify the diagnosis Discussion and conclusion Mass spectrometry is considered a useful diagnostic test to confirm the etiology of amyloidosis, especially if other methods are insufficient to establish it.

Detection of Microorganisms in Clinical Sonicated Orthopedic Devices Using Conventional Culture and qPCR / Detecção de microrganismos em dispositivos ortopédicos sonicados clínicos usando cultura convencional e qPCR

Abstract Objective To evaluate the sensitivity and specificity of the quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) for 16S rDNA gene screening using sonicated fluid from orthopedic implants. Methods A retrospective study was conducted on 73 sonicated fluids obtained from patients with infection associated with orthopedic implants. The samples were subjected to conventional culture and molecular testing using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and qPCR for 16S rDNA. The cycle threshold values were used to define a cut-off of the qPCR of the 16S rDNA for negative and positive cultures. Results No statistical differences were observed between the positive and negative culture groups based on the time from the first surgery to infection (p= 0.958), age (p =0.269), or general comorbidities. Nevertheless, a statistical difference was found between the mean duration of antibiotic use before device removal (3.41 versus 0.94; p =0.016). Bacterial DNA was identified in every sample from the sonicated fluids. The median cycle thresholds of the positive and negative cultures were of 25.6 and 27.3 respectively (p< 0.001). As a diagnostic tool, a cycle threshold cut-off of 26.89 demonstrated an area under the curve of the receiver operating characteristic of 0.877 (p≤ 0.001). Conclusion The presence of antimicrobial agents for more than 72 hours decreased culture positivity, but did not influence the qPCR results. Despite this, amplification of the 16S rDNA may overestimate infection diagnosis.

Resumo Objetivo Avaliar a sensibilidade e a especificidade da reação em cadeia de polimerase em tempo real quantitativa (quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR, em inglês) para a triagem do gene rDNA 16S, com a utilização do fluido sonicado de implantes ortopédicos. Métodos Um estudo retrospectivo foi realizado em 73 fluidos sonicados obtidos de pacientes com infecção associada aos implantes ortopédicos. As amostras foram submetidas a cultura convencional e a teste molecular utilizando ionização e dessorção a laser assistida por matriz com espectrometria de massa por tempo de voo (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS, em inglês) e qPCR para o gene rDNA 16S. Os valores limiares do ciclo foram usados para definir um ponto de corte para a qPCR do gene rDNA 16S para culturas negativas e positivas. Resultados Não foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos de cultura positiva e negativa com base no tempo desde a primeira cirurgia até a infecção (p= 0,958), na idade (p= 0,269), ou nas comorbidades em geral. No entanto, uma diferença estatística foi encontrada entre a duração média do uso de antibióticos antes da remoção do dispositivo (3,41 versus 0,94; p= 0,016). O DNA bacteriano foi identificado em todas as amostras dos fluidos sonicados. Os limiares do ciclo médio de culturas positivas e negativas foram de 25,6 e 27,3, respectivamente (p< 0,001). Como uma ferramenta de diagnóstico, um corte do limite do ciclo de 26,89 demonstrou uma área sob a curva da característica de operação do receptor de 0,877 (p ≤ 0,001). Conclusão A presença de agentes antimicrobianos por mais de 72 horas diminuiu a positividade da cultura, mas não influenciou os resultados da qPCR. Apesar disso, a amplificação do rDNA 16S pode sobrestimar o diagnóstico de infecção.

Relevant aspects on biomonitoring of heavy metal concentration in environmental air in Asunción city / Aspectos relevantes del Biomonitoreo de la concentración de metales pesados en el aire ambiental de la ciudad de Asunción

ABSTRACT Introduction. Bryophytes (mosses) have long been used to determine the concentration of heavy metals as an alternative to the collection of atmospheric aerosols. Objective. To evaluate the environmental concentration of lead, cadmium, mercury and arsenic in autochthonous species of moss and to analyze some methodological aspects of biomonitoring in Paraguay. Methodology. In an observational study moss samples were obtained from sub rural zone to be transplanted in 5 sites of high vehicular traffic in Asunción city. The samples were left outdoors for 58 days and then collected and subjected to study using the inductive coupling plasma source mass spectrometry technique. The bryophytes were characterized and all the climatological variables during the study period were consigned. Results. Lead concentrations detected in moss explants exposed to the urban environment were higher than mosses from natural forest, while arsenic levels in the latter were higher than those found in bryophytes transferred to the city. No conspicuous levels of cadmium and mercury were found. The bryophytes used belonged to two families: Hypnaceae and Pilotrichaceae. The range of temperature, relative humidity, wind and precipitation did not reach extreme levels during the studied period. Conclusion. The different lead levels measured here, could be surrogates of urban pollution while the notorious arsenic level in natural forest moss points to other sources like wildfires. Several aspects of the biomonitoring methodology are discussed.

RESUMEN Introducción. Las briofitas (musgos) se han utilizado durante mucho tiempo para determinar la concentración de metales pesados como alternativa a la recolección de aerosoles atmosféricos. Objetivo. Evaluar la concentración ambiental de plomo, cadmio, mercurio y arsénico en especies autóctonas de musgo y analizar algunos aspectos metodológicos de la biomonitorización en Paraguay. Metodología. En un estudio observacional se obtuvieron muestras de musgo de una zona sub-rural para ser trasplantadas en cinco sitios de alto tráfico vehicular en Asunción. Las muestras se dejaron a la intemperie durante 58 días y luego se recogieron para la medición de metales pesados por espectrometría de masas con fuente de plasma de acoplamiento inductivo. Se caracterizaron las briofitas y se consignaron todas las variables climatológicas durante el período de estudio. Resultados. Las concentraciones de plomo detectadas en los explantes de musgo expuestos al medio urbano fueron superiores a las de los musgos del bosque natural, mientras que los niveles de arsénico en estos últimos fueron superiores a los encontrados en los briófitos trasladados a la ciudad. No se encontraron niveles llamativos de cadmio y mercurio. Las briofitas utilizadas pertenecían a dos familias: Hypnaceae y Pilotrichaceae. Los rangos de temperatura, humedad relativa, viento y precipitación no alcanzaron niveles extremos durante el periodo estudiado. Conclusión. Los diferentes niveles de plomo medidos podrían ser subrogados de polución urbana mientras que el notorio nivel de arsénico en musgo de bosque natural apunta a otro tipo de fuentes como los incendios forestales. Se discuten varios aspectos de la metodología de biomonitorización.

Avaliação de resíduos de agrotóxicos em amostras de farinha de trigo por espectrometria de massas / Evaluation of pesticide residues in wheat flour by mass spectrometry

Os cereais são uma importante fonte alimentícia e econômica, dentre eles se destaca o trigo e sua farinha. Durante o cultivo, visando o controle de pragas, frequentemente são utilizados os agrotóxicos, porém seu uso abusivo pode acarretar danos à saúde humana e ao meio ambiente. O trabalho teve como objetivo avaliar a presença de resíduos de agrotóxicos em amostras de farinha de trigo comercializadas no estado de São Paulo, utilizando o método QuEChERS (Rápido, Fácil, Barato, Efetivo, Robusto e Seguro) modificado, seguido de análise por CG-EM/EM e CLUE-EMAR para identificação e quantificação. No total, 124 ingredientes ativos (i.a.) estavam dentro dos critérios de aceitação para linearidade, limites de detecção e quantificação, exatidão e precisão (intervalo de confiança de 95%; k = 2). Os resultados de 25 amostras indicaram a presença de bifentrina, fenitrotiona, clorpirifós, deltametrina, lambda-cialotrina e pirimifós-metílico em farinha de trigo comum e os quatro últimos i.a. também foram detectados em farinha de trigo orgânica. O pirimifósmetílico foi detectado em 92% das amostras. Os i.a. encontrados nas amostras estavam abaixo do Limite Máximo de Resíduos (LMR) estabelecidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) para farinha de trigo e as amostras foram consideradas próprias para o consumo (AU).

Cereals are an important economic factor and food source, which wheat and its flour stand out. Pesticides are often employed to control harmful organisms, but their abusive use can cause damage to human health and the environment. This study aimed to evaluate the presence of pesticide residues in wheat flour samples commercialized in the state of São Paulo ­ Brazil, using the modified QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) method, followed by GC-MS/MS and UHPLC-HRMS analysis for identification and quantification. Thus, 124 active ingredients (a.i.) were within acceptable criteria for linearity, limits of detection and quantification, accuracy (trueness), and precision (95% confidence level; k = 2). The results for 25 wheat flour samples showed the presence of bifenthrin, fenitrothion, chlorpyrifos, deltamethrin, lambda-cyhalothrin, and pirimiphos-methyl, and the last four a.i. were also detected in organic wheat flour. Pirimiphos-methyl was detected in 92% of all samples. All compounds were found below the Maximum Residue Levels (MRL) established by Brazilian Health Regulatory Agency (Anvisa) for wheat flour and the samples were considered suitable for consumption (AU).

Identificación directa de microorganismos a partir de hemocultivos positivos utilizando espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) / Direct identification of microorganisms in positive blood culture bottles by mass spectrometry (MALDI-TOF MS)

Resumen La espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) permite la identificación de microorganismos directamente de las colonias en pocos minutos. En este estudio se ha desarrollado y evaluado un protocolo reducido para identificar microorganismos directamente de las botellas de hemocultivos positivos en 30 minutos con una alta sensibilidad y especificidad, utilizando MALDITOF. Un total de 2535 hemocultivos positivos fueron estudiados por el método directo de MALDI-TOF MS, a partir de una alícuota de sangre de las botellas y el método de colonia, utilizando los cultivos desarrollados en medios sólidos. Del total de hemocultivos positivos incluidos en este estudio, 2381 (93,9%) fueron monomicrobianos y 146 (5,8%) polimicrobianos. Mil trescientos treinta (55,9%) de los aislamientos correspondieron a cocos gram positivos, 922 (38,7%) a bacilos gram negativos, 60 (2,5%) a anaerobios, 36 (1,5%) a bacilos gram positivos y 13 a levaduras. La concordancia global entre ambos métodos fue del 81,7% a nivel de especie (90,0% para bacilos gram negativos, 76,7% para cocos gram positivos y 33,3% para bacilos gram positivos). Se identificó al menos un germen en el 88% de las botellas positivas con desarrollo polimicrobiano. Los resultados del presente estudio demostraron que el protocolo basado en MALDI-TOF MS permite la identificación microbiana directamente de hemocultivos positivos en un tiempo corto, con una alta precisión, con excepción de los bacilos gram positivos.

Abstract Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) enables the identification of microorganisms directly from colonies within minutes. In this study this technology was adapted and tested for use with blood culture bottles, thus allowing identification in 30 minutes once the blood culture is detected as positive by the automate. A total of 2535 blood culture bottles reported as positive were tested by MALDI-TOF MS directly from positive blood culture bottles and colonies. A total of 2381 (93.9%) and 146 (5.8%) of the positive blood cultures were monomicrobial and polymicrobial, respectively. And 1330 (55.9%), 922 (38.7%), 60 (2.5%), 36 (1.5%) and 13 of the isolates were gram-positive cocci (GPC), gram-negative bacilli (GNB), anaerobic bacteria, gram-positive bacilli (GPB) and yeast respectively. Concordance between both methods was 81.7% (76.7% of GPC, 90% of GNB, 74.2% of anaerobic bacteria and 33.3% of GPB) in monomicrobial cultures. Eighty eight per cent of the polymicrobial cultures were identified correctly in at least one of the two bacteria. The results of the present study show that this fast, MALDI-TOF MS based method allows microbial identification directly from positive blood culture in a short time, with a high accuracy, with the exception of gram-positive bacilli.

Resumo A espectrometria de massa (MALDI-TOF MS) permite a identificação de microorganismos diretamente das colônias em minutos. Nesse estudo, foi desenvolvido um protocolo reduzido para identificar microrganismos diretamente das garrafas de hemoculturas positivas em 30 minutos com alta sensibilidade e especificidade, utilizando MALDI-TOF. Um total de 2535 hemoculturas positivas foram relatadas -o método direto de MALDI-TOF MS, a partir de uma alíquota de sangue dos vidros e o método de colônia, a partir das culturas desenvolvidas em meios sólidos. Do total de hemoculturas positivas incluídas neste estudo, 2.381 (93,9%) eram monomicrobianas e 146 (5,8%) eram polimicrobianas. Mil trezentos e trinta (55,9%) dos isolados corresponderam a cocos gram-positivos, 922 (38,7%) bacilos gram-negativos, 60 (2,5%) anaeróbios, 36 (1,5%) bacilos gram-positivos e 13 leveduras. A concordância geral entre os dois métodos foi de 81,7% em nivel de especie (90,0% para bacilos gram-negativos, 76,7% para cocos gram-positivos e 33,3% para bacilos gram-positivos). Pelo menos um germe foi identificado em 88% dos vidros positivos com desenvolvimento polimicrobiano. Os resultados do presente estudo demonstraram que o protocolo baseado em MALDI-TOF MS permite a identificação microbiana diretamente de hemoculturas positivas em um curto espaço de tempo, com alta precisão, com exceção de bacilos gram-positivos.

Identificação e caracterização bioquímica de inibidores de serinopeptidases isolados a partir da peçonha das anêmonas-do-mar Anthopleura cascaia e Aulactinia veratra

Phylum Cnidaria comprises more than 10,000 species and around 10% of them are represented by sea anemones. These animals are underexplored sources of molecules, possessing structurally diverse toxins that can act over a diverse range of pharmacological targets, including enzymes. Sea anemones represent almost 96% of the manually annotated toxins from the phylum, but until now only 5% of its species have been studied about their toxin content. In the present work, the venoms of the sea anemones Anthopleura cascaia and Aulactinia veratra were studied and accessed through mass spectrometry analysis for searching serine peptidase inhibitors. The arsenal of toxins from both venoms was elucidated. Additionally, venom’s fractions were screened for inhibitory activity over trypsin, using time-course fluorescence-based kinetic assays or Mass spectrometry-based analysis. Beyond that, the spatial distribution of serine peptidase inhibitors in both sea anemones’ tissues were shown through Mass Spectrometry Imaging by MALDITOF. In the analysis of toxins composition, it was seen that A. cascaia venom presents at least three types of toxins: cytolysins, phospholipases and a toxin similar to natterin. For A. veratra, the classification based on blastp hit similarity and relying on domain architecture of the toxin’s sequences (translated transcripts) was performed. The thorough examination over toxins sequences led to the identification of 59 proteins and peptides belonging to 14 known toxin’s families of sea anemones and to the acknowledge of 20 peptides presenting 18 new cysteine scaffolds. The venom of this sea anemone mainly relies on neurotoxins from ShK-like, β-defensins, SCRiP, ICK, EGF-like types and on serine peptidase inhibitors from Kazal and Kunitz types. Furthermore, serine peptidase inhibitors from both venoms were isolated and present main distribution over tentacles, mesenterial filaments and pedal disc of these sea anemones, suggesting the preferential stock of these toxins. In conclusion, the methodological approaches applied in this study were able of identifying the presence of serine peptidase inhibitors on the venom and tissue of sea anemones through chromatographic techniques followed by enzymatic assays, and MALDI-Imaging.

O filo Cnidaria é composto por mais de 10.000 espécies e cerca de 10% destas são anêmonas-do-mar. Estes animais são considerados fontes subexploradas de moléculas, possuindo um diverso arsenal de toxinas que podem agir sobre diferentes alvos farmacológicos, incluindo enzimas. Toxinas de anêmonas-do-mar representam cerca de 96% das toxinas anotadas para o filo Cnidaria, embora apenas 5% de suas espécies tenham sido estudadas quanto à composição de toxinas até o momento. Neste trabalho elucidamos por espectrometria de massas a composição da peçonha das anêmonas Anthopleura cascaia e Aulactinia veratra, buscando a identificação de inibidores de serinopeptidases. O arsenal de toxinas para ambas anêmonas foi elucidado. Ainda, descrevemos as etapas de purificação envolvidas na busca de inibidores e a seleção destes candidatos por meio da inibição da atividade da tripsina, avaliada por duas técnicas distintas։ Cinética enzimática e Espectrometria de massas. Adicionalmente, descrevemos a localização de candidatos a inibidores no tecido das anêmonas através do Imageamento por espectrometria de massas. Na análise sobre a composição de toxinas destas anêmonas, vimos que a peçonha da A. cascaia apresentou a existência três tipos de toxinas incluindo citolisinas, fosfolipases e naterinas. Para a espécie A. veratra, a classificação de toxinas baseadas no blastp hit e na arquitetura de domínios das toxinas foi realizada. Esta análise revelou a presença de 59 proteínas e peptídeos pertencentes a 14 famílias de toxinas de anêmonasdo-mar; além do reconhecimento de 20 peptídeos apresentando 18 novos scaffolds de cisteínas. A peçonha desta anêmona é principalmente composto por neurotoxinas do tipo ShK-like, β-defensinas, SCRiP, ICK, EGF-like e inibidores de serinopeptidases. Os dados obtidos mostram que ambas anêmonas são ricas fontes de inibidores de serinopeptidases, especialmente tipo Kunitz e Kazal. Tais inibidores apresentam distribuição na região dos tentáculos, mesentério e disco pedal das anêmonas, o que pode indicar o estoque preferencial destas toxinas. E conclusão, o conjunto de abordagens metodológicas empregadas neste trabalho foi capaz de atender os objetivos propostos: identificar a presença de inibidores de serinopeptidases na peçonha e tecido de anêmonas, tanto por fracionamento cromatográfico seguido de ensaio enzimático, quanto por MALDI-Imaging.

Proteomic analysis identifies molecular players and biological processes specific to SARS-CoV-2 exposure in endothelial cells

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) has been responsible for the severe pandemic of acute respiratory disease, coronavirus disease 2019 (COVID-19), experienced in the 21st century. The clinical manifestations range from mild symptoms to abnormal blood coagulation and severe respiratory failure. In severe cases, COVID-19 manifests as a thromboinflammatory disease. Damage to the vascular compartment caused by SARS-CoV-2 has been linked to thrombosis, triggered by an enhanced immune response. The molecular mechanisms underlying endothelial activation have not been fully elucidated. We aimed to identify the proteins correlated to the molecular response of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) after exposure to SARS-CoV-2, which might help to unravel the molecular mechanisms of endothelium activation in COVID-19. In this direction, we exposed HUVECs to SARS-CoV-2 and analyzed the expression of specific cellular receptors, and changes in the proteome of HUVECs at different time points. We identified that HUVECs exhibit non-productive infection without cytopathic effects, in addition to the lack of expression of specific cell receptors known to be essential for SARS-CoV-2 entry into cells. We highlighted the enrichment of the protein SUMOylation pathway and the increase in SUMO2, which was confirmed by orthogonal assays. In conclusion, proteomic analysis revealed that the exposure to SARS-CoV-2 induced oxidative stress and changes in protein abundance and pathways enrichment that resembled endothelial dysfunction.

Isolamento e caracterização das toxinas causadoras de priapismo do veneno do escorpião Leiurus quinquestriatus

Scorpionism is considered a serious public health issue around the world. One of the most important species is the Leiurus quinquestriatus, popularly known as `Death seeker`. It is predominantly found in the Saara and the Arabic peninsula. Its venom causes autonomic reactions as blood pressure oscillations, hypersalivation. Priapism is frequently associated to this scorpion sting. Considering the importance of this issue, the primary objective of this study is to isolate and characterize the toxin(s) involved in priapism present in this venom. Crude desiccated venom was obtained from a qualified commercial supplier. The activity-driven purification strategy was employed in which RP-HPLC steps were developed in order to achieve the highest purity of a fraction capable of inducing priapism in mice. We successfully isolated a fraction named 10C, composed by isoforms. The fraction was further analyzed by MALDI-TOF and ESI-IT- TOF/MS after reduction, alkylation and trypsin digestion and yielded a predominant molecular mass of 7230Da. Comparing the partial sequences in public databases for toxins, we identified similarities with eight toxins: Alpha-insect toxin (Lqq3), Alpha-toxin (Lqq4); Alpha-like toxin (Lqh6); Alpha-mammal toxin (Lqq5); Alpha-like toxin (Lqh3); Alpha-mammal toxin (Lqh2); Neurotoxin 2; Neurotoxin h3.1. The fraction 10C seems to produce fewer side effects as hypersalivation and death than other priapism-inducing toxins isolated from spiders previously studied by our group. Next steps include the complete proteomics of the L. quinquestriatus venom, as well as the identification of the target of these toxins by affinity chromatography and other methods.

O escorpionismo é considerado como um grave problema de saúde pública mundial, considerada uma das espécies mais venenosa, Leiurus quinquestriatus, conhecido popularmente como o perseguidor da morte, encontrada principalmente na região do Saara e a Península Árabe, seu veneno causa manifestações sistêmicas como consequência da hiperativação do sistema nervoso autônomo, levando à sintomas como o priapismo, um efeito incomum à picada do escorpião. O priapismo tem sido descrito com frequência em casos de acidentes por este escorpião. Tendo em vista a relevância desse tema, o objetivo deste trabalho é purificar e isolar o peptídeo responsável por causar o priapismo presente em seu veneno. O veneno bruto dessecado foi adquirido de fornecedor comercial qualificado. As etapas de purificação foram desenvolvidas empregando-se o HPLC em coluna de fase reversa. Foi usada a estratégia de purificação acompanhada de atividade, na qual as frações de veneno obtidas em cada etapa eram testadas quanto a ação do priapismo. Com esta estratégia conseguimos isolar uma fração que se denominou 10C. A fração foi analisada por espectrometria de massa MALDI-TOF e ESI-IT-TOF/MS. Foi encontrado para o pico 10C a massa molecular predominante de 7230Da. A avaliação das sequencias de amino ácidos obtidos após redução e digestão parcial, em comparação contra bases de dados de toxinas mostrou similaridade com oito peptídeos, a saber: Alpha-insect toxin (Lqq3), Alpha-toxin (Lqq4); Alpha-like toxin (Lqh6); Alpha-mammal toxin (Lqq5); Alpha-like toxin (Lqh3); Alpha-mammal toxin (Lqh2); Neurotoxin 2; Neurotoxin h3.1. Os testes em animais sugerem que haja menos efeitos secundários como hipersalivação e morte. Nos próximos passos será realizado o estudo proteômico do veneno bruto e a análise de receptores para esta classe de toxinas com a utilização de técnicas de cromatografia de afinidade.

Cultura celular de linhagens celulares tumorais e análise proteômica baseada em espectrometria de massas: análise do efeito de veneno da serpente Bothrops jararaca

As técnicas de cultura celular são utilizadas desde o começo do século XX e vêm ganhando espaço em diferentes áreas de pesquisa. Um exemplo é na farmacodinâmica, em estudos cujo objetivo é observar o efeito de drogas, biofarmacos e compostos tóxicos, como venenos de serpentes. O veneno de serpentes é composto por uma mistura complexa de proteínas, peptídeos, aminoácidos, nucleotídeos, lipídeos e carboidratos que apresentam uma gama de ações isoladas ou em conjunto. Diversos estudos têm sido realizados a fim de analisar o potencial uso de venenos para o tratamento de doenças tais como o câncer utilizando diferentes metodologias, sendo duas delas: a cultura celular utilizando linhagens celulares tumorais e a proteômica. Proteômica consiste na análise dos conjuntos de proteínas e suas isoformas expressas em uma amostra biológica, podendo ser um organismo, tecido ou célula. A análise proteômica baseada em espectrometria de massas é uma técnica que separa e identifica proteínas por meio da medição de sua massa, medida com base na relação massa/carga de íons em fase gasosa. O presente trabalho busca analisar e caracterizar o perfil morfológico e proteômico das linhagens celulares tumorais sob efeito do veneno da serpente Bothrops jararaca a partir da cultura de células tumorais MCF-7 e MDA-MB-231. Foram observadas diferentes morfologias entre as diferentes linhagens celulares após tratamento com baixa (0,63 mg/mL) e alta dose sub-citotóxica (2,5 mg/mL) de veneno. A análise por espectrometria de massas permitiu a identificação de diferentes proteínas em cada uma das amostras e a presença de proteínas comuns entre amostras controle e tratadas com as diferentes doses de veneno. Trabalhos subsequentes utilizando doses diferentes de veneno e tempo de tratamento permitirão melhor caracterizar o perfil proteômico das diferentes linhagens tumorais sob efeito do veneno de B. jararaca.

Caracterização de cereja-do-rio grande (Eugenia involucrata DC. ) e grumixama (Eugenia brasiliensis LAM. ), frutos nativos da Mata Atlântica, quanto a compostos voláteis e precursores / Volatile compounds and precursors characterization of the Grumixama (Eugenia brasiliensis LAM. ) and Cereja-do-Rio-Grande (Eugenia involucrata DC. ), atlantic forest native fruits

Mesmo reduzida e fragmentada, o vasto bioma da Mata Atlântica abriga milhares de plantas. Como destaque, tem-se as espécies frutíferas, aos quais podem ser atribuídas um importante valor para a segurança alimentar, nutricional e sociocultural. Entre elas, têm-se a cereja-do-rio grande (Eugenia involucrata DC.) e a grumixama (Eugenia brasiliensis Lam.), caracterizadas pela polpa de sabor doce-acidulado, sendo muito apreciadas e utilizadas tanto in natura, quanto no preparo de doces, xaropes, licores e geleias. Uma das características determinantes para o sucesso e aceitação destes frutos pelo consumidor, são os atributos de qualidade sensorial. As propriedades aromáticas dos frutos dependem da potência individual dos voláteis e a concentração de cada um, bem como a combinação com outros compostos. Todavia, apesar do grande potencial de mercado, devido às características nutricionais, fitoterápicas, potencial funcional e ao sabor exótico, os plantios existentes destas são oriundos de multiplicação por sementes, resultando em plantas desuniformes quanto as características de produção e qualidade. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo identificar metabólitos voláteis que confiram características sensoriais desejáveis aos frutos. Auxiliando na identificação de plantas que produzem frutos com voláteis de interesse para o sabor, o que permitirá a clonagem e propagação de plantas com homogeneidade na produção. Os compostos voláteis foram analisados em triplicata, de acordo com o método de microextração em fase sólida (SPME, do inglês Solid Phase Microextraction). Os resultados mostraram que os grupos de frutos das diversas regiões se diferenciaram quanto a composição dos metabolitos voláteis, bem como na abundância destes compostos. Observou-se também uma variação de composição entre as árvores da mesma região demonstrando tal irregularidade ocasionada pela propagação por sementes. A maioria de compostos voláteis produzidos foram identificados como terpenos, sendo estes já conhecidos pela importância no flavor em frutos. Desta forma, conhecer o aroma fornecerá um conjunto de dados que são subsídios para outros pesquisadores trabalharem em suas diversas áreas buscando características necessárias para o sucesso da comercialização, ocasionando no incentivo ao cultivo e valorização da riqueza nacional, no âmbito das espécies frutíferas, com vistas à proteção ambiental e em defesa da biodiversidade brasileira

The Atlantic Forest harbors thousands of plants despite of its reduced and fragmented character. It is important to highlight the fruit species which hold attributed and important value for food and socio-cultural security. Among them, there are the big cherry (Eugenia involucrata DC.) And the grumixama (Eugenia brasiliensis Lam.), fruit with sweet-acidulated flavor, which is much appreciated and used in the preparation of sweets, syrups, liqueurs, and jellies. One of the determining characteristics for the success and acceptance of these fruits by the consumer are the attributes of sensorial quality. The aromatic properties of the fruits depend on the individual potency of the volatiles and the concentration in each one of them, as well as the combination with other compounds. Despite of the great market potential due to the nutritional, phytotherapic and exotic flavor characteristics, the existing plantations of these fruits are originated from seed multiplication, resulting on uneven plants in terms of production and quality characteristics. In this sense, the presented work below was aimed to identify volatile metabolites that confer desirable sensorial characteristics to the fruits. The volatile compounds were analyzed in triplicate according to the Solid Phase Microextraction (SPME) method. The results showed that the fruit groups from different regions differed in terms of the composition of volatile metabolites, as well as in the abundance of these compounds. There was also a variation of composition among the trees of the same region which demonstrated such heterogeneity caused by seed propagation. Most volatile compounds produced were identified as terpenes which are known for playing an important role in the flavor of fruits. In this way, by knowing the aroma, a set of data will be provided and used as an allowance for other researchers who are working in the various areas related to the pursue of the necessary characteristics for the commercial success, resulting on the motivation to cultivate and value the forest

Venenos de serpentes do gênero Bothrops: impacto da glicosilação na complexidade dos proteomas e função de toxinas / Bothrops snake venoms: impact of glycosylation on the complexity of proteomes and toxins function

A variabilidade estrutural é uma característica das proteínas de venenos de serpentes, e a glicosilação é uma das principais modificações pós-traducionais que contribui para a diversificação de seus proteomas. Recentes estudos de nosso grupo demonstraram que venenos do gênero Bothrops são marcadamente definidos pelo seu conteúdo de glicoproteínas, e que a maioria das estruturas de N-glicanos dos tipos híbrido e complexo identificados em oito venenos deste gênero contêm unidades de ácido siálico. Em paralelo, em glicoproteínas do veneno de B. cotiara foi identificada a presença de uma estrutura de N-acetilglicosamina bissecada. Assim, com o objetivo de investigar a variação do conteúdo de glicoproteínas, assim como os mecanismos envolvidos na geração dos diferentes venenos de Bothrops, neste estudo foram analisados comparativamente os glicoproteomas de nove venenos do gênero Bothrops (B. atrox, B. cotiara, B. erythromelas, B. fonsecai, B. insularis, B. jararaca, B. jararacussu, B. moojeni e B. neuwiedi). As abordagens glicoproteômicas envolveram cromatografia de afinidade e ensaio de pull-down utilizando, respectivamente, as lectinas SNA (aglutinina de Sambucus nigra) e MAL I (lectina de Maackia amurensis), que mostram afinidade por unidades de ácido siálico nas posições, respectivamente, α2,6 e α2,3; e cromatografia de afinidade com a lectina PHA-E (eritroaglutinina de Phaseolus vulgaris), que reconhece N-acetilglicosamina bissecada. Ainda, eletroforese de proteínas, blot de lectina, e identificação de proteínas por espectrometria de massas foram empregadas para caracterizar os glicoproteomas. As lectinas geraram frações dos venenos enriquecidas de diferentes componentes, onde as principais classes de glicoproteínas identificadas foram metaloprotease, serinoprotease, e L-amino ácido oxidase, além de outras enzimas pouco abundantes nos venenos. Os diferentes conteúdos de proteínas reconhecidas por essas lectinas, com especificidades distintas, ressaltaram novos aspectos da variabilidade dos subproteomas de glicoproteínas desses venenos, dependendo da espécie. Ainda, considerando que metaloproteases e serinoproteases são componentes abundantes nesses venenos e fundamentais no quadro de envenenamento botrópico, e que estas enzimas contêm diversos sítios de glicosilação, o papel das unidades de ácido siálico na atividade proteolítica das mesmas foi avaliado. Assim, a remoção enzimática de ácido siálico (i) alterou o padrão de gelatinólise em zimografia da maioria dos venenos, (ii) diminuiu a atividade proteolítica de alguns venenos sobre o fibrinogênio e a atividade coagulante do plasma humano de todos os venenos, e (iii) alterou o perfil de hidrólise de proteínas plasmáticas pelo veneno de B. jararaca, indicando que este carboidrato pode desempenhar um papel na interação das proteases com seus substratos proteicos. Em contraste, o perfil da atividade amidolítica dos venenos não se alterou após a remoção de ácido siálico e incubação com o substrato Bz-Arg-pNA, indicando que ácido siálico não é essencial em N-glicanos de serinoproteases atuando sobre substratos não proteicos. Em conjunto, esses resultados expandem o conhecimento sobre a variabilidade de proteomas de venenos do gênero Bothrops e apontam a importância das cadeias de carboidratos contendo ácido siálico nas atividades enzimáticas das proteases desses venenos

Structural variability is a feature of snake venom proteins, and glycosylation is one of the main post-translational modifications that contributes to the diversification of venom proteomes. Recent studies by our group have shown that Bothrops venoms are markedly defined by their glycoprotein content, and that most hybrid and complex N-glycan structures identified in eight venoms of this genus contain sialic acid units. In parallel, the presence of a bisected N-acetylglucosamine structure was identified in B. cotiara venom glycoproteins. Thus, with the aim of investigating the variation in the content of glycoproteins, as well as the mechanisms involved in the generation of different Bothrops venoms, in this study the glycoproteomes of nine Bothrops venoms (B. atrox, B. cotiara, B. erythromelas, B. fonsecai, B. insularis, B. jararaca, B. jararacussu, B. moojeni e B. neuwiedi) were comparatively analyzed. The glycoproteomic approaches involved affinity chromatography and pulldown using, respectively, the lectins SNA (Sambucus nigra agglutinin) and MAL I (Maackia amurensis lectin), which show affinity for sialic acid units at positions, respectively, α2,6 and α2,3, and affinity chromatography with PHA-E (Phaseolus vulgaris erythroagglutinin), which recognizes bisected N-acetylglucosamine. In addition, protein electrophoresis, lectin blot, and protein identification by mass spectrometry were employed for glycoproteome characterization. The lectins generated venom fractions enriched with different components, where the main classes of glycoproteins identified were metalloprotease, serine protease, and L-amino acid oxidase, in addition to other low abundant enzymes. The different contents of proteins recognized by these lectins of distinct specificities highlighted new aspects of the variability of the glycoprotein subproteomes of these venoms, depending on the species. Furthermore, considering that metalloproteases and serine proteases are abundant components of these venoms and essential in Bothrops envenomation, and that these enzymes contain several glycosylation sites, the role of sialic acid units in their proteolytic activities was evaluated. Thus, enzymatic removal of sialic acid (i) altered the pattern of gelatinolysis in zymography of most venoms, (ii) decreased the proteolytic activity of some venoms on fibrinogen and the clotting activity of human plasma of all venoms, and (iii) altered the hydrolysis profile of plasma proteins by B. jararaca venom, indicating that this carbohydrate may play a role in the interaction of proteases with their protein substrates. In contrast, the profile of amidolytic activity of the venoms did not change after removal of sialic acid and incubation with the substrate Bz-Arg-pNA, indicating that sialic acid is not essential in N-glycans of serine proteases acting on small substrates. Together, these results expand the knowledge about the variability of proteomes of Bothrops venoms and point to the importance of carbohydrate chains containing sialic acid in the enzymatic activities of venom proteases