Participação da via do Hedgehog na fibrose hepática da esquistossomose mansoni humana e murina experimental / Participation via the Hedgehog in liver fibrosis of human schistosomiasis and experimental murine

INTRODUÇÃO/OBJETIVO: A esquistossomose mansonica é causa importante de fibrose hepática e hipertensão porta em regiões tropicais, e a patogênese da fibrose não está bem esclarecida. Como a via do hedgehog e um dos seus genes alvos,a osteopontina, estão envolvidos em fibroses hepáticas de outras etiologias o objetivo foi investigar a ativação destas vias na esquIsitossomose humana e murina experimental, no intuito de verificar o seu envolvimento no desenvolvimento da forma hepatoesplênica da esquistossomose mansonica (FHE). MATERIAL E MÉTODOS: 87 biópsias em cunha de fígados de pacientes com FHE submetidos a cirurgia e fragmentos de fígado de camundongos suiços infectados com Schistosoma mansoni foram submetidos a métodos imunohistoquímicos e de biologia molecular para avaliar a expressão de ligantes hedgehog (Ihh, Shh), receptor Patched, fatores de transcrição Gli 1 e 2 e osteopontina. Osteopontina sérica e ligante Shh do hedgehog foram avaliados em camundongos suíços infectados e os de osteopontina em camundongos CBA/J infectados e em pacientes com FHE e forma hepatointestinal da esquistossomose. In vitro foi avaliado o efeito de antígeno solúvel do ovo (SEA) em células de Kuppfer, células estreladas, macrófagos, colangiócitos e células endoteliais sinusoidais hepáticas. A relação com a via da IL-13 foi avaliada em camundongos geneticamente deficientes ou hiperexpressando a citocina. Foi avaliado in vitro se a IL-13 induz ligantes hedghog ou ativação da via em células de Kuppfer. RESULTADOS: Os resultados mostraram: (a) aumento expressão de ligantes Ihh, de fatores de transcrição Gli2 e de osteopontina no fígado de camundongos suíços infectados com Schistosoma mansoni, aumento de shh e osteopontina no plasma de camundongos suíços e de osteopontina no plasma de camundongos CBA/J infectados com S. mansoni; (b) aumento na expressão de Ihh, Shh, Gli1 e 2, receptor Patched e de osteopontina no fígado de pacientes com esquistossomose e aumento da osteopontina sérica em pacientes com a FHE; (c) A expressão de ligantes hedgehog e de Gli2 foi observada em macrófagos, células estreladas, ductos biliares e células endoteliais, e a de osteoponina em ductos biliares,macrófagos e células estreladas/miofibroblastos; (d) correlação positiva entre ativação do hedgehog (Gli2 e osteopontina) e fibrose, no modelo murino experimental e nos pacientes; nestes a correlação também foi observada com o grau de fibrose classificada pelo ultrassom e com a hipertensão porta; (e) Inibição in vitro do hedgehog com ciclopamina e vismodegib ou por nocauteamento condicional de receptor Smoothened bloqueou a ativação alternativa de macrófagos e inibiu a angiogênese a partir de células endoteliais sinusoidais hepáticas; (f) que o bloqueio da via da IL-13 reduziu e a hiperexpressão aumentou a ativação da via do hedgehog e IL-13 diretamente induziu, in vitro,produção de ihh em células de Kupffer de camundongos e de humanos, demonstrando a inter-relação das duas vias...

BACKGROUND AND AIMS: Schistosomiasis is a major cause of liver fibrosis and portal hypertension in tropical regions, and the pathogenesis of fibrosis is not well established. As hedgehog pathway and one of its target genes, osteopontin, are involved in liver fibrosis of other etiologies our aims were to investigate the activation of these pathways in human and experimental murine schistosomiasis, in an attempt to verify their involvement in the development of hepatosplenic schistosomiasis mansoni (HS). METHODS: 87 wedge liver biopsies of patients with HS submitted to surgery and liver fragments Swiss mice infected with Schistosoma mansoni were submitted to immunohistochemistry and molecular biology methods to evaluate the expression of hedgehog ligands (Ihh, Shh), patched receptor , Gli transcription factors and osteopontin. Serum osteopontin and Shh were evaluated in infected Swiss mice and osteopontin was evaluated in serum of infected CBA/J mice and plasma from patients with hepatointestinal and HS forms of schistosomiasis. The effect of soluble egg antigen (SEA) on Kuppfer cells, stellate cells, macrophages, cholangiocytes and liver sinusoidal endothelial cells was evaluated in vitro. Relationship with IL-13 pathway was evaluated in mice genetically deficient or with hyperexpression of this cytokine. Whether IL-13 induces production of ligands and/or activation of the hedgehog pathway in Kuppfer cells was evaluated in vitro. RESULTS: Results demonstrated: (a) increased expression of Ihh, transcription factor Gli2 and osteopontin in the livers of Swiss mice infected with S. mansoni, increased plasma levels of shh and osteopontin in infected Swiss mice and increased osteopontin in plasma of S. mansoni infected CBA/J mice; (b) increased expression of ihh, shh, Gli1 and 2, patched and osteopontin receptor in the liver of patients with schistosomiasis and increased serum osteopontin in patients with HS; (c) expression of hedgehog ligands and Gli2 was observed in macrophages, stellate cells, endothelial cells and bile duct and expression of osteopontin was detected in macrophages and stellate/myofibroblast cells; (d) positive correlation between activation of the hedgehog (Gli2 and osteopontin) and fibrosis in experimental murine model and in patients; these correlation was also observed with the degree of fibrosis classified by ultrasound and with portal hypertension; (e) in vitro inhibition of hedgehog pathway with cyclopamine or vismogedib or by conditional knockout of Smoothened co-receptor blocked the alternative activation of macrophage and inhibited angiogenesis in liver sinusoidal endothelial cells; (f) reduction of IL-13 pathway or IL-13 over-expression respectively reduced or increased the activation of the hedgehog pathway and IL-13 directly induced in vitro ihh production in Kupffer cells from mice and human, demonstrating a cross-talk between the two pathways...

Participação da via do Hedgehog na fibrose hepática da esquistossomose mansoni humana e murina experimental / Participation via the Hedgehog in liver fibrosis of human schistosomiasis and experimental murine

INTRODUÇÃO/OBJETIVO: A esquistossomose mansonica é causa importante de fibrose hepática e hipertensão porta em regiões tropicais, e a patogênese da fibrose não está bem esclarecida. Como a via do hedgehog e um dos seus genes alvos, a osteopontina, estão envolvidos em fibroses hepáticas de outras etiologias o objetivo foi investigar a ativação destas vias na esquIsitossomose humana e murina experimental, no intuito de verificar o seu envolvimento no desenvolvimento da forma hepatoesplênica da esquistossomose mansonica (FHE). MATERIAL E MÉTODOS: 87 biópsias em cunha de fígados de pacientes com FHE submetidos a cirurgia e fragmentos de fígado de camundongos suiços infectados com Schistosoma mansoni foram submetidos a métodos imunohistoquímicos e de biologia molecular para avaliar a expressão de ligantes hedgehog (Ihh, Shh), receptor Patched, fatores de transcrição Gli 1 e 2...

inglês: BACKGROUND AND AIMS: Schistosomiasis is a major cause of liver fibrosis and portal hypertension in tropical regions, and the pathogenesis of fibrosis is not well established. As hedgehog pathway and one of its target genes, osteopontin, are involved in liver fibrosis of other etiologies our aims were to investigate the activation of these pathways in human and experimental murine schistosomiasis, in an attempt to verify their involvement in the development of hepatosplenic schistosomiasis mansoni (HS). METHODS: 87 wedge liver biopsies of patients with HS submitted to surgery and liver fragments Swiss mice infected with Schistosoma mansoni were submitted to immunohistochemistry and molecular biology methods to evaluate the expression of hedgehog ligands (Ihh, Shh), patched receptor , Gli transcription factors and osteopontin...

Histomorphometry of hepatic portal fibrosis in patients with surgical schistosomiasis mansoni

The usual histology report of hepatic fibrosis in patients with hepatosplenic schistosomiasis mansoni presents no association with hemodynamic and clinical liver parameters. Histomorphometry is adding a new tool of investigation for measuring density of portal fibrosis in these patients. This investigation was set up for assessing a possible agreement between the well-accepted international classification and the fibrosis density grades measured by histomorphometry. Thirty-five children and equal number of adults were included in this study. All patients underwent splenectomy and ligature of the left gastric vein. Histology findings were assessed in surgical liver biopsy stained with Masson trichrome. The official histology report was used as reference. The histomorphometric studies were done by semi-automatic morphometry. The mean percentage (X) of portal fibrosis plus or minus one standard deviation (SD) was classified as grade II (7.06% up to 34.72%); grade I was up to 7.06%; and grade III above 34.72%. Although, not reaching statistical significance, there is a tendency of the fibrosis to be more intense in children than adults (X±SD - 22.02±13.46% versus 20.63%±15.33% "t" = 0.379 p>0.05). Seven out of nine (77.8%) patients classified as grade I, by morphometry, had the same result on the official report, however, two (22.2%) were described as grade III. Sixteen out of forty-four (36.4%) classified as grade II on morphometry had the same classification as the histology grade, but, twenty seven (61.4%) were classified as grade III and one (2.3%) as grade I. Fifteen (21.4%) out of 70 patients had grade III on both classifications, but, two (11.8%) out of seventeen G III on morphometry were grade II. The kappa (k) measurement of agreement between both classification was k = 0.319, showing a fair strength of association. The histomorphometric measurements of Symmers fibrosis in surgical patients with mansonic schistosomiasis partially support the report from The Department of Pathology - University Hospital, Federal University of Pernambuco - Brazil. However, there is a discrepancy in grade III. While in the official classification, the majority (62.8%) accounts for this grade, on morphometry only 38.6% represent the same grade. On the contrary, on morphometry, similar majority (62.8%) is grade II.

O relato usual de fibrose hepática em pacientes com esquistossomose mansônica na forma hepato-esplênica não apresenta associação com os parâmetros clínico-hemodinâmicos e de reserva funcional hepática. A histomorfometria adicionou uma nova ferramenta de investigação para medir a densidade da fibrose portal nesses pacientes. Esta investigação teve como objetivo investigar uma possível concordância entre a bem aceita classificação internacional clássica e os graus de densidade da fibrose portal medidos pela histomorfometria. Trinta e cinco crianças e igual número de adultos foram incluídos nesse estudo. Todos os pacientes foram submetidos a esplenectomia e ligadura da veia gástrica esquerda. Os achados histológicos foram avaliados em biópsias hepáticas cirúrgicas coradas pelo tricômico de Masson. O relato histológico oficial (clássico) foi usado como referência. Os estudos histomorfométricos foram feitos por morfometria semi-automática. A percentagem média (X) da fibrose portal ± um desvio padrão (DP) foi classificado como grau II (7,06 até 34,72%); grau I foi até 7,06%; e grau III acima de 34,72%. Embora não alcançando significação estatística ocorreu uma tendência da fibrose ser mais intensa nas crianças que nos adultos (X ± DP - 22,02 ± 13,46% versus 20,63% ± 15,33% "t" = 0,379 p > 0,005). Sete de nove (77,8%) pacientes classificados como grau I, pela morfometria, tiveram a mesma classificação no relato oficial, contudo, dois (22,2%) foram descritos como grau III. Dezesseis de 44 (36,4%) classificados como grau II na morfometria tiveram a mesma classificação na histologia clássica, entretanto, 27 (61,4%) foram classificados como grau III e um (2,3%) como grau I. Quinze (21,4%) de 70 pacientes tiveram grau III em ambas as classificações, mas, dois (11,8%) de dezessete pacientes grau III na morfometria foram grau II na histologia. A medida de concordância kappa (k) entre ambas as classificações foi k=0,319, mostrando uma discreta força de associação. As medidas histomorfométricas da fibrose de Symmers em pacientes cirúrgicos portadores de esquitossomose mansônica dão suporte parcial ao relato oficial do Departamento de Patologia do Hospital das Clínicas - Universidade Federal de Pernambuco. Contudo, existe uma discrepância no grau III. Enquanto na classificação oficial a maioria (62,8%) é constituída por pacientes grau III, na morfometria, a maioria (62,8%) é grau II.

Histomorphometry of hepatic portal fibrosis in patients with surgical schistosomiasis mansoni

The usual histology report of hepatic fibrosis in patients with hepatosplenic schistosomiasis mansoni presents no association with hemodynamic and clinical liver parameters. Histomorphometry is adding a new tool of investigation for measuring density of portal fibrosis in these patients. This investigation was set up for assessing a possible agreement between the well-accepted international classification and the fibrosis density grades measured by histomorphometry. Thirty-five children and equal number of adults were included in this study. All patients underwent splenectomy and ligature of the left gastric vein. Histology findings were assessed in surgical liver biopsy stained with Masson trichrome. The official histology report was used as reference. The histomorphometric studies were done by semi-automatic morphometry. The mean percentage (X) of portal fibrosis plus or minus one standard deviation (SD) was classified as grade II (7.06% up to 34.72%); grade I was up to 7.06%; and grade III above 34.72%. Although, not reaching statistical significance, there is a tendency of the fibrosis to be more intense in children than adults (X±SD - 22.02±13.46% versus 20.63%±15.33% "t" = 0.379 p>0.05). Seven out of nine (77.8%) patients classified as grade I, by morphometry, had the same result on the official report, however, two (22.2%) were described as grade III. Sixteen out of forty-four (36.4%) classified as grade II on morphometry had the same classification as the histology grade, but, twenty seven (61.4%) were classified as grade III and one (2.3%) as grade I. Fifteen (21.4%) out of 70 patients had grade III on both classifications, but, two (11.8%) out of seventeen G III on morphometry were grade II. The kappa (k) measurement of agreement between both classification was k = 0.319, showing a fair strength of association. The histomorphometric measurements of Symmers fibrosis in surgical patients with mansonic schistosomiasis partially support the report from The Department of Pathology - University Hospital, Federal University of Pernambuco - Brazil. However, there is a discrepancy in grade III. While in the official classification, the majority (62.8%) accounts for this grade, on morphometry only 38.6% represent the same grade. On the contrary, on morphometry, similar majority (62.8%) is grade II.

O relato usual de fibrose hepática em pacientes com esquistossomose mansônica na forma hepato-esplênica não apresenta associação com os parâmetros clínico-hemodinâmicos e de reserva funcional hepática. A histomorfometria adicionou uma nova ferramenta de investigação para medir a densidade da fibrose portal nesses pacientes. Esta investigação teve como objetivo investigar uma possível concordância entre a bem aceita classificação internacional clássica e os graus de densidade da fibrose portal medidos pela histomorfometria. Trinta e cinco crianças e igual número de adultos foram incluídos nesse estudo. Todos os pacientes foram submetidos a esplenectomia e ligadura da veia gástrica esquerda. Os achados histológicos foram avaliados em biópsias hepáticas cirúrgicas coradas pelo tricômico de Masson. O relato histológico oficial (clássico) foi usado como referência. Os estudos histomorfométricos foram feitos por morfometria semi-automática. A percentagem média (X) da fibrose portal ± um desvio padrão (DP) foi classificado como grau II (7,06 até 34,72%); grau I foi até 7,06%; e grau III acima de 34,72%. Embora não alcançando significação estatística ocorreu uma tendência da fibrose ser mais intensa nas crianças que nos adultos (X ± DP - 22,02 ± 13,46% versus 20,63% ± 15,33% "t" = 0,379 p > 0,005). Sete de nove (77,8%) pacientes classificados como grau I, pela morfometria, tiveram a mesma classificação no relato oficial, contudo, dois (22,2%) foram descritos como grau III. Dezesseis de 44 (36,4%) classificados como grau II na morfometria tiveram a mesma classificação na histologia clássica, entretanto, 27 (61,4%) foram classificados como grau III e um (2,3%) como grau I. Quinze (21,4%) de 70 pacientes tiveram grau III em ambas as classificações, mas, dois (11,8%) de dezessete pacientes grau III na morfometria foram grau II na histologia. A medida de concordância kappa (k) entre ambas as classificações foi k=0,319, mostrando uma discreta força de associação. As medidas histomorfométricas da fibrose de Symmers em pacientes cirúrgicos portadores de esquitossomose mansônica dão suporte parcial ao relato oficial do Departamento de Patologia do Hospital das Clínicas - Universidade Federal de Pernambuco. Contudo, existe uma discrepância no grau III. Enquanto na classificação oficial a maioria (62,8%) é constituída por pacientes grau III, na morfometria, a maioria (62,8%) é grau II.

Bone mineral content reduction in youth with surgical form of Schistosomiasis mansoni: factors involved in the pathogenesis

Thirty two children and adolescents from 14 to 20 years of age, suffering from hepatosplenic schistosomiasis mansoni and bleeding esophageal varicose veins, were evaluated for bone mineral density (BMD), before undergoing medical and surgical treatment. The surgical protocol was splenectomy, autoimplantation of spleen tissue into a pouch of the major omentum and ligature of the left gastric vein. Follow up of these patients ranges from one to ten years with a mean of five years. The BMD was measured at the lumbar spine (L2 - L4) through the dual energy absorptionmetry X-ray (DEXA), using a LUNAR DPX-L densitometer. The degree of Symmers´ fibrosis was assessed by semiautomatic hystomorphometry. In eleven patients, the serum magnesium was measured before an intravenous overload of this ion and subsequently after eight and twenty four hours. Urine was collected 24 hours before and 24 hours after the magnesium overload. Deficiency of magnesium was considered when the uptake of this ion was greater than 40%. There was a significant trend of association between the status of bone mineral content and the Symmers´ fibrosis degree (c² = 6.606 R = 0.01017). There was also a moderate agreement between the greater fibrosis densities ( > the mean percentage) and bone mineral deficits. Although the normal bone mineral content was more found among the patients with better hepatic functional reserve, the results did not reach statistical significance. There was a marked magnesium retention (>95%) in one patient who had severe osteoporosis and a slight depletion ( 5%) in another patient, who presented no bone mineral deficit. It was concluded that the patients included in this series, showed an important BMD deficit, specially among the females which has had a significant improvement after medical and surgical treatment. Bone mineral deficit was associated with the degree of Symmers´ fibrosis. Magnesium depletion was present in two out of eleven patients. It is speculated that magnesium supplementation may be warranted to forestall the progression of bone mineral deficit in patients with more impaired hepatic functional reserve.

Trinta e duas crianças e adolescentes, de 14 a 20 anos de idade, portadores de esquistossomose mansônica na forma hepatoesplênica e varizes sangrentas do esôfago, foram avaliadas para conteúdo mineral ósseo (BMD), antes de serem submetidas a tratamento clínico-cirúrgico. O protocolo cirúrgico constou de esplenectomia, ligadura da veia gástrica esquerda e autoimplante de tecido esplênico em bolsa no omento maior. O seguimento pós-operatório desses pacientes varia entre um e dez anos, com uma média de cinco anos. O BMD foi medido na vértebra lombar (L2-l4), através de aparelho de raio-X de dupla absorção e energia (DEXA), usando um densitômetro modelo LUNAR DPX-L. O grau de fibrose de Symmers foi avaliado por histomorfometria semi-automática. Em onze pacientes, o magnésio sérico foi medido antes e subseqüentemente oito e vinte e quatro horas após infusão desse íon. A deficiência de magnésio foi considerada quando a retenção desse íon fosse maior que 40%. Houve uma tendência à associação entre o padrão do conteúdo mineral ósseo e o grau da fibrose de Symmers (c² = 6,606 R = 0,01017). Houve ainda uma moderada concordância entre o maior grau de densidade fibrótica (acima da percentagem média) e o déficit mineral ósseo. Embora o conteúdo mineral ósseo normal estivesse mais evidente entre os pacientes com melhor reserva funcional hepática, os resultados não alcançaram significação estatística. Houve uma acentuada retenção de magnésio infundido (>95%) em uma paciente que tinha osteoporose e uma retenção desse íon discretamente acima de 40% em um paciente que não apresentava déficit conteúdo mineral ósseo. Em conclusão, os pacientes incluídos nesta série mostravam um importante déficit de BMD, especialmente entre as meninas, que obtiveram melhora significativa após tratamento clínico e cirúrgico. O déficit mineral ósseo desses pacientes estava associado ao grau de fibrose de Symmers. Depleção de magnésio esteve presente em dois de onze desses pacientes. Pode-se especular que a suplementação de magnésio possa ser útil para deter a progressão do déficit do conteúdo mineral ósseo nos pacientes com reserva funcional hepática mais comprometida.