Interação tumor-estroma durante a transição epitéliomesenquimal in vitro: envolvimento da integrina a11b1 e modulação da Crotoxina sobre este processo / Tumor-stroma interaction during in vitro epithelialmesenchymal transition: involvement of integrin a11 B1 and modulatory effect of Crotoxin on this process

During tumor progression, tumor cells are regulated by the microenvironment and acquire highly proliferative behavior within the epithelial compartment, having as characteristic the high motility and invasiveness to the adjacent stroma! tissue. This behavior is a result of the phenotypic alteration of epithelial tumor cells, due to a biological process called epithelial-rnesenchymal transition (EMT). ln this process, fibroblasts are pointed out as fundamental elements in the EMT induction, performing their functions via integrins. Recently, a11 has been shown to be a type I collagen receptor of mesenchyme-derived cells, particularly fibroblasts, which promote cell adhesion and migration to this substrate and may also contribute to the invasion of tumor cells, making it thus, an important target of study. Components obtained from snake venoms modulate integrin-mediated functions, resulting in modulation of cell signaling and consequently regulation of events involved with tumor progressions, such as proliferation, migration, and apoptosis. The aim of this study was 1) to evaluate in vitro the role of a11 integrin on EMT and its importance in the phenotype stabilization; 2) to evaluate the possible inhibitory effect of CTX on the function of this integrin in fibroblasts in spheroid model and; 3) to evaluate the modulatory effect of CTX on key markers in EMT in spheroid model. Firstly, epithelial cell lines (NMuMG and A549) treated with EMT-inducing factors were used to evaluate the expression of epithelial and mesenchymal markers. Secondly, the experimental model used was in vitro interaction between cancer-associated fibroblasts (CAFs-mock or CAF-a11) or normal fibroblasts (MRC-5) and tumor cell lines (A549 or Calu-3), evaluating: a) tumor cells proliferation inside the spheroids; b) invasion and migratory behavior of composite spheroids in type I collagen gel; c) secretion of TGF-ß1 by CAFs; d) expression of EMT markers: E-cadherin, N-cadherin, vimentin and a-SMA, by immunofluorescence assay and Western blotting; e) quantification of MMPs (9 and 13) by ELISA. Taken together, the data obtained allow us to assert that a11 integrin is modulated by growth factors involved with EMT and that its participation was fundamental for the stabilization of the myofibroblastic phenotype. CTX interfered with CAFs adhesion, tumor cells proliferation and its inhibitory effect during migration and cell invasion is more significant when the tumor-stroma interaction occurs in the spheroid model, accompanied by inhibition of the secretion of active TGF-ß1. Furthermore, CTX inhibited differentiation of MRC-5 cells in the tumor microenvironment and inhibited the expression of N-cadherin, a-SMA and av mesenchymal markers, evaluated in 2D or 3D matrices, by Western blot and confocal microscopy. This study shows CTX as an important modulatory molecule of the EMT process and highlights the mechanisms involved in the antitumor action described for CTX in experimental studies and clinical trials.

Durante a progressão tumoral, as células tumorais são reguladas pelo microambiente e adquirem comportamento altamente proliferativo dentro do compartimento epitelial, tendo como característica a alta motilidade e invasividade ao tecido estremai adjacente. Este comportamento é resultado da alteração fenotípica das células turnarais epiteliais, decorrente de um processo biológico denominado transição epitélio-mesenquimal (EMT). Neste processo, os fibroblastes são apontados como elementos fundamentais na indução da EMT, desempenhando suas funções via integrinas. Muito recentemente, foi demonstrado que a a11 é um receptor para colágeno tipo I de células derivadas do mesênquima, particularmente de fibroblastes, que promovem a adesão e migração celular a este substrato podendo, ainda, contribuir para a invasão das células turnarais, tornando-a assim, um importante alvo de estudo. Componentes obtidos de venenos de serpentes modulam funções mediadas por integrinas, resultando na modulação da sinalização celular e consequentemente, sobre a regulação de eventos envolvidos com a· progressão tumoral, tais como a proliferação, migração e apoptose. Portanto, este estudo tem como objetivos: 1) avaliar in vitro a participação da integri na a11 sobre a EMT e sua importância na estabilização do fenótipo; 2) avaliar o possível efeito inibitório da CTX sobre a função desta integrina em fibroblastes no modelo de esferóide e; 3) avaliar o efeito modulatório da CTX sobre os marcadores-chave na EMT, em modelo de esferóide. Para tanto, primeiramente, foi utilizado linhagens de células epiteliais (NMuMG e A549) tratadas com fatores indutores da EMT para avaliação da expressão dos marcadores epiteliais e mesenquimais. Para o segundo delineamento experimental, foi empregado a interação in vitro entre as linhagens de fibroblastos associados ao câncer (CAFs-mock ou CAF-a11) ou fibroblastos normais (MRC-5) e as linhagens de célula tumoral (A549 ou Calu-3) no modelo de esferóide, avaliando-se: a) a proliferação de células turnarais dentro dos esferóides; b) a invasão e o comportamento migratório dos esferóides compostos no gel de colágeno tipo I; c) a secreção de TGF-ß1 pelas CAFs; d) a expressão das moléculas-chave da EMT: E-caderina, N-caderina, vimentina e a-SMA, por meio do ensaio de imunofluorescência e de Western blotting; e) quantificação de MMPs (9 e 13) por ELISA. Em conjunto, os dados obtidos nos permite afirmar que a integrina a11 é modulada por fatores de crescimentos envolvidos com a EMT e que sua participação foi fundamental para estabilização do fenótipo miofibroblástico. CTX interferiu com a adesão de CAFs e proliferação das células tumorais. O efeito inibitório da CTX durante a migração e invasão celular foi mais significativo quando ocorreu a interação tumor-estroma no modelo de esferóide, acompanhado da inibição da secreção de TGF-ß1 ativo. Ainda, a CTX inibiu a diferenciação de células MRC-5 no microambiente tumoral e inibiu a expressão dos marcadores mesenquimais Ncaderina, a-SMA e av, avaliados em matrizes 20 ou 30, por Western blot e microscopia confocal. Este estudo mostra a CTX como importante molécula moduladora do processo EMT e evidencia os mecanismos envolvidos na ação antitumoral descrita para a CTX em estudos experimentais e ensaios clínicos.

Interação tumor-estroma durante a transição epitéliomesenquimal in vitro: envolvimento da integrina a11b1 e modulação da Crotoxina sobre este processo. / Tumor-stroma interaction during in vitro epithelialmesenchymal transition: involvement of integrin a11 B1 and modulatory effect of Crotoxin on this process.

During tumor progression, tumor cells are regulated by the microenvironment and acquire highly proliferative behavior within the epithelial compartment, having as characteristic the high motility and invasiveness to the adjacent stroma! tissue. This behavior is a result of the phenotypic alteration of epithelial tumor cells, due to a biological process called epithelial-rnesenchymal transition (EMT). ln this process, fibroblasts are pointed out as fundamental elements in the EMT induction, performing their functions via integrins. Recently, a11 has been shown to be a type I collagen receptor of mesenchyme-derived cells, particularly fibroblasts, which promote cell adhesion and migration to this substrate and may also contribute to the invasion of tumor cells, making it thus, an important target of study. Components obtained from snake venoms modulate integrin-mediated functions, resulting in modulation of cell signaling and consequently regulation of events involved with tumor progressions, such as proliferation, migration, and apoptosis. The aim of this study was 1) to evaluate in vitro the role of a11 integrin on EMT and its importance in the phenotype stabilization; 2) to evaluate the possible inhibitory effect of CTX on the function of this integrin in fibroblasts in spheroid model and; 3) to evaluate the modulatory effect of CTX on key markers in EMT in spheroid model. Firstly, epithelial cell lines (NMuMG and A549) treated with EMT-inducing factors were used to evaluate the expression of epithelial and mesenchymal markers. Secondly, the experimental model used was in vitro interaction between cancer-associated fibroblasts (CAFs-mock or CAF-a11) or normal fibroblasts (MRC-5) and tumor cell lines (A549 or Calu-3), evaluating: a) tumor cells proliferation inside the spheroids; b) invasion and migratory behavior of composite spheroids in type I collagen gel; c) secretion of TGF-ß1 by CAFs; d) expression of EMT markers: E-cadherin, N-cadherin, vimentin and a-SMA, by immunofluorescence assay and Western blotting; e) quantification of MMPs (9 and 13) by ELISA. Taken together, the data obtained allow us to assert that a11 integrin is modulated by growth factors involved with EMT and that its participation was fundamental for the stabilization of the myofibroblastic phenotype. CTX interfered with CAFs adhesion, tumor cells proliferation and its inhibitory effect during migration and cell invasion is more significant when the tumor-stroma interaction occurs in the spheroid model, accompanied by inhibition of the secretion of active TGF-ß1. Furthermore, CTX inhibited differentiation of MRC-5 cells in the tumor microenvironment and inhibited the expression of N-cadherin, a-SMA and av mesenchymal markers, evaluated in 2D or 3D matrices, by Western blot and confocal microscopy. This study shows CTX as an important modulatory molecule of the EMT process and highlights the mechanisms involved in the antitumor action described for CTX in experimental studies and clinical trials.

Durante a progressão tumoral, as células tumorais são reguladas pelo microambiente e adquirem comportamento altamente proliferativo dentro do compartimento epitelial, tendo como característica a alta motilidade e invasividade ao tecido estremai adjacente. Este comportamento é resultado da alteração fenotípica das células turnarais epiteliais, decorrente de um processo biológico denominado transição epitélio-mesenquimal (EMT). Neste processo, os fibroblastes são apontados como elementos fundamentais na indução da EMT, desempenhando suas funções via integrinas. Muito recentemente, foi demonstrado que a a11 é um receptor para colágeno tipo I de células derivadas do mesênquima, particularmente de fibroblastes, que promovem a adesão e migração celular a este substrato podendo, ainda, contribuir para a invasão das células turnarais, tornando-a assim, um importante alvo de estudo. Componentes obtidos de venenos de serpentes modulam funções mediadas por integrinas, resultando na modulação da sinalização celular e consequentemente, sobre a regulação de eventos envolvidos com a· progressão tumoral, tais como a proliferação, migração e apoptose. Portanto, este estudo tem como objetivos: 1) avaliar in vitro a participação da integri na a11 sobre a EMT e sua importância na estabilização do fenótipo; 2) avaliar o possível efeito inibitório da CTX sobre a função desta integrina em fibroblastes no modelo de esferóide e; 3) avaliar o efeito modulatório da CTX sobre os marcadores-chave na EMT, em modelo de esferóide. Para tanto, primeiramente, foi utilizado linhagens de células epiteliais (NMuMG e A549) tratadas com fatores indutores da EMT para avaliação da expressão dos marcadores epiteliais e mesenquimais. Para o segundo delineamento experimental, foi empregado a interação in vitro entre as linhagens de fibroblastos associados ao câncer (CAFs-mock ou CAF-a11) ou fibroblastos normais (MRC-5) e as linhagens de célula tumoral (A549 ou Calu-3) no modelo de esferóide, avaliando-se: a) a proliferação de células turnarais dentro dos esferóides; b) a invasão e o comportamento migratório dos esferóides compostos no gel de colágeno tipo I; c) a secreção de TGF-ß1 pelas CAFs; d) a expressão das moléculas-chave da EMT: E-caderina, N-caderina, vimentina e a-SMA, por meio do ensaio de imunofluorescência e de Western blotting; e) quantificação de MMPs (9 e 13) por ELISA. Em conjunto, os dados obtidos nos permite afirmar que a integrina a11 é modulada por fatores de crescimentos envolvidos com a EMT e que sua participação foi fundamental para estabilização do fenótipo miofibroblástico. CTX interferiu com a adesão de CAFs e proliferação das células tumorais. O efeito inibitório da CTX durante a migração e invasão celular foi mais significativo quando ocorreu a interação tumor-estroma no modelo de esferóide, acompanhado da inibição da secreção de TGF-ß1 ativo. Ainda, a CTX inibiu a diferenciação de células MRC-5 no microambiente tumoral e inibiu a expressão dos marcadores mesenquimais Ncaderina, a-SMA e av, avaliados em matrizes 20 ou 30, por Western blot e microscopia confocal. Este estudo mostra a CTX como importante molécula moduladora do processo EMT e evidencia os mecanismos envolvidos na ação antitumoral descrita para a CTX em estudos experimentais e ensaios clínicos.

Estudo dos processos de mobilização, ativação e apoptose das células da medula óssea em modelo de morte encefálica em ratos / Study of bone marrow cells mobilization, activation and apoptosis in brain dead rats

Estudos experimentais suportam a evidência de leucopenia persistente desencadeada pela morte encefálica (ME). OBJETIVO: Esse estudo teve como objetivo investigar o comportamento leucocitário na medula óssea e no sangue após a morte encefálica em ratos. MÉTODOS: A morte encefálica foi induzida através da inserção e insuflação rápida de um cateter no espaço intracraniano. Ratos falso-operados (FO) foram apenas trepanados. Decorridas seis horas, as células da medula óssea, coletadas da cavidade femural, foram utilizadas para as contagens total e diferencial e analisadas por citometria de fluxo para a caracterização das subpopulações linfocitárias, a expressão de moléculas de adesão granulocíticas e apoptose/necrose (método de Anexina V/Iodeto de Propídio (PI)). RESULTADOS: Ratos com ME apresentaram uma redução de 30% no número de células da medula óssea devido à redução de linfócitos (40%) e células segmentadas (45%). As subpopulações de linfócitos na medula óssea foram semelhantes nos animais ME e FO (CD3, p=0,1; CD4, p=0,4; CD3/CD4, p=0,4; CD5, p=0,4, CD3/CD5, p=0,2; CD8, p=0,8). A expressão de L-selectina e beta2-Integrinas nos granulócitos também não diferiram entre os grupos (CD11a, p=0,9; CD11b/c, p=0,7; CD62L, p=0,1). Não existem diferenças nas porcentagens de apoptose e de necrose (Anexina V, p=0,73; PI, p=0,21; Anexina V/PI, p=0,29). CONCLUSÃO: Os dados sugerem que a redução na mobilização de células da medula óssea para o sangue, desencadeada pela morte encefálica, não se relaciona a alterações de subpopulações de linfócitos, expressão de moléculas de adesão granulocíticas, ou apoptose e necrose...

Experimental findings support the evidence of a persistent leucopenia triggered by brain death (BD). AIMS: This study aimed to investigate leukocyte behavior in bone marrow and blood after BD in rats. METHODS: BD was induced by quickly inflation of an intracranial balloon catheter. Sham operated (SH) rats were trepanned only. Six hours thereafter bone marrow cells harvested from the femoral cavity were used for total and differential counts, and analyzed by flow cytometry to characterize lymphocyte subsets, granulocyte adhesion molecules expression, and apoptosis/necrosis (annexin V/propidium iodide (PI) protocol). RESULTS: BD rats exhibited a 30% reduction in bone marrow cells due to a reduction in lymphocytes (40%) and segmented cells (45%). Bone marrow lymphocyte subsets were similar in BD and SH rats (CD3, p=0.1; CD4, p=0.4; CD3/CD4, p=0.4; CD5, p=0.4, CD3/CD5, p=0.2; CD8, p=0.8). Expression of L-selectin and ?2-integrins on granulocytes did not differ (CD11a, p=0.9; CD11b/c, p=0.7; CD62L, p=0.1). There were no differences in the percentage of apoptosis and necrosis (Annexin V, p=0.73; PI, p=0.21; Annexin V/PI, p=0.29). CONCLUSIONS: Data presented suggest that the down-regulation of the bone marrow triggered by BD is not related to changes in lymphocyte subsets, granulocyte adhesion molecules expression, or apoptosis and necrosis...

Inflamacion subclinica en diabetes tipo 1 infanto-juvenil / Subclinical inflammation in children and adolescents with type 1 diabetes / Inflamação subclínica em crianças e adolescentes com diabetes tipo 1

En ninos y adolescentes con diabetes tipo 1 (DT1) puede aparecer precozmente un estado de inflamacion subclinica. El objetivo del trabajo fue determinar los niveles plasmaticos de moleculas proinflamatorias en una poblacion infanto-juvenil con DT1, sin evidencias clinicas de complicaciones vasculares y correlacionar estos parametros entre si y con el grado de control glucemico y tiempo de evolucion de la enfermedad. Se estudiaron 42 pacientes con DT1 (21M/21F), de 10 a 13 anos, que se compararon con un grupo control. Se evaluaron: recuento de leucocitos, formas solubles de E-selectina (sE-S) y molecula de adhesion celular vascular 1 (VCAM-1), mieloperoxidasa (MPO), TNF-á, Fibrinogeno (Fg) y uPCR. Los datos se expresaron como mediana y rango intercuartil. Los diabeticos presentaron niveles aumentados de: sE-S [108 (69-150) vs. 68 (52-86) ng/mL, p=0,003], VCAM-1 [785 (732-835) vs 712 (658-758) ng/mL, p=0,04], uPCR [1,00 (0,67-1,70) vs. 0,20 (0,18-0,87) mg/L, p=0,01]. No se observaron diferencias en las moleculas estudiadas segun el grado de control glucemico y tiempo de evolucion de la enfermedad. La uPCR se correlaciono con glucemia en ayunas, HbA1c, sE-S y VCAM1. Los niveles elevados de uPCR, sE-S y VCAM-1 sugieren un estado proinflamatorio asociado a activacion endotelial en ninos con DT1, potenciando el riesgo de enfermedad vascular.

In children and adolescents with type 1 diabetes (T1D), clinical manifestations of vascular complications are uncommon; however, endothelial disturbance and a pro-inflammatory state can emerge early. The objectives of this work were: I) to determine plasma levels of proinflammatory molecules in a T1D pediatric population with no clinical evidence of vascular complications; II) to correlate these parameters with each other, and with glycemic control degree and disease duration. Forty-two patients with T1D (21 M/21W), aged 10 and 13 years and an evolution time not more than 6 years were compared with a control group. The biochemical parameters evaluated were: WBC, sE-S and VCAM-1, MPO, TNF-á, hsCRP and plasma Fg. Glycemic control was performed by determining fasting glucose and HbA1c. Data were expressed as the median and interquartile range. Increased levels of sE-S [108 (69-150) vs. 68 (52-86) ng/mL, p=0.003], VCAM-1 [785 (732-835) vs. 712 (658-758) ng/mL, p=0.04], hsCRP [1.00 (0.67-1.70) vs. 0.20 (0.18- 0.87) mg/L, p=0.01] were found in diabetic patients compared with the control group. No differences in the studied molecules were observed when diabetic patients were grouped according to glycemic control degree and evolution of the disease. hsCRP correlated with fasting glucose, HbA1c, sE-S and VCAM-1. High hsCRP, sE-S and VCAM-1 levels suggest a proinflammatory state associated with endothelial activation in children and adolescents with T1D, potentiating the risk of vascular disease.

Em crianças e adolescentes com diabetes tipo 1 (DT1), um estado de inflamação subclínica pode aparecer de forma precoce. O objetivo do trabalho foi determinar os níveis plasmáticos de moléculas pró-inflamatórias em uma população infanto-juvenil com DM1 sem evidências clínicas de complicações vasculares e correlacionar estes parâmetros, entre si com o grau de controle glicêmico e tempo de evolução da doença. Foram estudados 42 pacientes com DM1 (21M/21F), de 10 a 13 anos, que foram comparados com um grupo controle. Foram avaliadas a contagem de leucócitos, formas solúveis de E-selectina (sE-S) e molécula de adesão celular vascular 1 (VCAM-1), mieloperoxidase (MPO), TNF-á, fibrinogênio (Fg) e PCRus. Os dados foram expressos como mediana e intervalo interquartil. Os pacientes diabéticos apresentaram níveis aumentados de SE-S [108 (69-150) vs. 68 (52-86) ng/mL, p=0,003], VCAM-1 [785 (732-835) vs. 712 (658-758) ng/mL, p=0,04], PCRus [1,00 (0,67-1,70) vs. 0,20 (0,18-0,87) mg/L, p=0,01]. Não foram observadas diferenças nas moléculas estudadas segundo o grau de controle glicêmico e tempo de evolução da doença. O PCRus foi correlacionado com glicemia em jejum, HbA1c, sES e VCAM1. Os níveis elevados de PCRus, sE-S e VCAM-1 sugerem um estado pró-inflamatório associado com a ativação do endotélio em crianças com DM1, aumentando o risco de doença vascular.

Papel da insulina na vigência da peritonite decorrente da infecção por Staphylococcus aureus em animais diabéticos e sadios / Insulin role in peritonitis presence due to Staphylococcus aureus infection in diabetic and healthy animals

A nefropatia diabética é uma doença crônica caracterizada por falência renal, que torna necessária a hemodiálise. A diálise peritoneal é uma alternativa para a hemodiálise, porém causa peritonite e morte, principalmente devido à infecção com Staphylococcus aureus, especialmente em pacientes imunodeprimidos, como pacientes diabéticos. Nossa hipótese é que a insulina possa modular a peritonite causada por S. aureus. Para tanto, investigamos sua intervenção, após a indução de diabetes mellitus, na infecção peritoneal por cepas diferentes de S. aureus, analisando os mecanismos moleculares (produção/liberação de citocinas, expressão de moléculas de adesão) e a atividade microbicida dos macrófagos peritoneais envolvidos. Ratos Wistar, machos, diabéticos (aloxana, 42 mg/kg, i.v., 10 dias) e respectivos controles (salina, i.v.) foram submetidos à injeção intraperitoneal de uma suspensão de S. aureus (5x109 CFU/mL) ou volume equivalente de PBS estéril. Os animais foram submetidos a dois tratamentos com insulina NPH: 1) dose única (1UI e 4UI respectivamente, controle e diabético), administrada por via subcutânea; ou, 2) com 4 doses sendo a primeira administrada 2 horas antes da infecção, seguida de metade desta dose às 17 horas e no mesmo horário pelos próximos 2 dias (dose inicial 4UI e 1UI, grupo diabético e grupo controle, respectivamente), passadas 16 horas da última dose de insulina, a glicemia foi determinada e, em seguida, foi realizada eutanásia e coleta de amostras. Avaliamos: a) número de células no lavado peritoneal (LPe), leucograma e glicemia (monitor de glicose); b) níveis séricos de corticosterona e insulina (ELISA); c) concentrações de citocinas (IL-1ß, TNF-α, IL-6, IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-12) e quimiocinas (CINC-1, CINC-2, CINC-3) no sobrenadante do LPe (ELISA); d) expressão de moléculas de adesão (P-selectina, PECAM-1, ICAM-1) no endotélio vascular (imunoistoquímica); e) atividade microbicida. Após a infecção com a cepa ATCC 25923, comparados aos não infectados, ratos diabéticos apresentaram aumento no número de leucócitos (350%) e nas concentrações de CINC-1 (1900%), IL-1ß (1300%), IFN-γ (280%), IL-4 (800%). O tratamento destes animais com dose única de insulina diminuiu as concentrações de CINC-1 (17%) e IFN-γ (30%) e o leucócitos (55%); e aumentou a concentração de IL-4 (260%); enquanto o tratamento com 4 doses diminuiu o número de leucócitos (82%) e as concentrações de CINC-1 (96%) e CINC-2 (45%); e, aumentou as concentrações de TNF-α (270%), IFN-γ (220%), IL-1ß (42%), IL-6 (760%) e a expressão de ICAM-1 (1360%); enquanto as concentrações de CINC-3, IL-10 e IL-12 não foram alteradas pelos tratamentos com insulina. Após a infecção com a cepa N315 HLA+, comparados aos não infectados, ratos diabéticos apresentaram aumento do número de leucócitos (200%), nas concentrações de CINC-1 (1000%), IL-4 (860%), IFN-γ (200%) e na expressão de PECAM-1 (800%) e diminuição de CINC-2 (92%). O tratamento destes animais com dose única de insulina diminuiu a concentração de CINC-1 (85%); e aumentou a concentração de CINC-2 (2030%), IL-1ß (370%) e IL-4 (250%); enquanto o tratamento com 4 doses diminuiu a concentração de CINC-1 (92%); e, aumentou número de leucócitos (66%), as concentrações de CINC-2 (100%), IL-1ß (490%), IL-6 (1870%) e IFN-γ (330%), e os outros parâmetros não foram modificados pelos diferentes tratamentos com insulina. Estes dados sugerem que a insulina possa modular a peritonite induzida por cepas diferentes de S. aureus, controlando pelo menos em parte, o infiltrado inflamatório, a produção das citocinas CINC-1, CINC-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF-α e IL-1ß; e, consequentemente a expressão P-selectina e PECAM-1 no endotélio vascular do mesentério

Diabetic nephropathy is a chronic disease characterized by kidney failure, so hemodialysis is necessary. Peritoneal dialysis is an alternative to hemodialysis, but causes peritonitis and death primarily due to infection by Staphylococcus aureus, especially in immunocompromised patients, such as diabetics. Our hypothesis is that insulin can modulate peritonitis caused by S. aureus, therefore, we investigated its action, after diabetes induction, in peritoneal infection with different S. aureus strains, analyzing the molecular mechanisms (cytokines production/release, adhesion molecules expression) and the microbicidal activity of peritoneal macrophages involved. Wistar male diabetic (alloxan, 42 mg/kg, iv, 10 days) and their respective controls (saline,iv) were subjected to intraperitoneal injection of S. aureus suspension (5x109CFU/mL) or an equivalent volume of PBS sterile. Animals were submitted to two treatments with NPH insulin administered subcutaneously : single dose (1IU and 4IU respectively , control and diabetic) 8 hours prior to euthanasia ; or 4 doses : first dose 2 hours before infection (4IU and 1IU , diabetic and control group, respectively), then half this dose of 17 pm and in the same time for the next 2 days, after 16 hours of the last dose, blood glucose was determined, and then it was carried out euthanasia and sampling. We evaluated: a) number of cells in peritoneal wash (PW), white blood cell count and blood sugar (glucose monitor) ; b) serum insulin and corticosterone (ELISA); c) concentrations of cytokines (IL-1ß, TNF-α, IL-6, IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-12) and chemokines (CINC -1, CINC-2, CINC-3 ) in supernatant of the SBA assay (ELISA); d) expression of adhesion molecules (P- selectin, ICAM-1, PECAM-1) in vascular endothelium ( immunohistochemistry); e) microbicidal activity. After infection with ATCC 25923 strain, compared to uninfected, diabetic rats showed an increase in leukocytes number (350%) and in concentrations of CINC-1 (1900%), IL-1ß (1300%), IFN-γ (280%), IL-4 (800%). Treatment of these animals with a single dose of insulin decreased concentrations of CINC-1 (17%) and IFN-γ (30%) and leukocytes number (55%); and increased IL-4 concentrations (260%); while treatment with 4 doses decreased leukocytes number (82%) and concentrations of CINC-1 (96%) and CINC-2 (45%); and increased concentrations of TNF-α (270%), IFN-γ (220%), IL-1ß (42%), IL-6 (760%) and expression of ICAM-1 (1360%); while the concentrations of CINC-3, IL-10 and IL-12 were not affected by treatments with insulin. After infection with N315 HLA+ strain, compared to uninfected, diabetic rats showed an increase in leukocytes (200%), concentrations of CINC-1 (1000%), IL-4 (860%), IFN-γ (200%) and in the expression of PECAM-1 (800%); and CINC-2 decrease (92%). Treatment of these animals with a single dose of insulin decreased the concentration of CINC-1 (85%); and increased concentrations of CINC-2 (2030%), IL-1ß (370%) and IL-4 (250%); while treatment with 4 doses decreased the concentration of CINC-1 (92%); and increased leukocytes number (66%), concentrations of CINC-2 (100%), IL-1ß (490%), IL-6 (1870%) and IFN-γ (330%), and other parameters were not modified by treatments with insulin. These results suggest that both S. aureus strains activate differently the innate response during peritonitis, and insulin was not always able to modulate this response

Adhesion molecules in breast carcinoma: a challenge to the pathologist / Moléculas de adesão no carcinoma mamário: um desafio ao patologista

The role of adhesion molecules is very important both in the activation of carcinogenesis and in the differentiation of subtypes of breast carcinoma, aiding in diagnosis, prognosis and therapeutic choice in these tumors. Therefore, understanding the functions and interrelationships among these molecules is crucial to the pathologist, who often uses these factors as a resource to differentiate tumors and further classify them according to a molecular point of view. Our goal is to describe the applicability and the difficulties encountered by the pathologist in the diagnosis of breast carcinoma, discussing the most commonly used markers of adhesion in routine analyses.

O papel das moléculas de adesão é de suma importância tanto na ativação da carcinogênese quanto na diferenciação dos subtipos de carcinomas mamários, auxiliando no diagnóstico, no prognóstico e na escolha terapêutica nessas neoplasias. Portanto, a compreensão das funções e das inter-relações entre essas moléculas é de suma importância para o patologista, que, muitas vezes, as utiliza como recurso na diferenciação dos tumores e, consequentemente, elas auxiliam em uma posterior classificação do ponto de vista molecular. O objetivo é descrever a aplicabilidade e as dificuldades encontradas pelo médico patologista no diagnóstico de carcinoma mamário, discutindo os marcadores de adesividade mais utilizados na rotina.

Ativação endotelial na granulomatose com poliangeíte (granulomatose de Wegener) / Endothelial activation in granulomatosis with polyangiits

INTRODUÇÃO: Eventos vasculares e imunológicos são centrais na patogênese da granulomatose com poliangeíte (GPA). Moléculas de adesão celular tem papel fundamental no recrutamento de células inflamatórias do sangue para os tecidos. Diferentes leitos vasculares apresentam particularidades na expressão de moléculas de adesão celular explicando talvez parte da especificidade da GPA por determinados órgãos. A elevação no nível sérico de moléculas de adesão celular e aumento da expressão destas em amostras de biópsia renal já foram demonstrados em pacientes com vasculite ANCA associada. No entanto, o fenômeno ainda não foi estudado in situ no pulmão. OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi analisar o padrão de expressão endotelial pulmonar de três moléculas de adesão celular na GPA, in situ: molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1), molécula e adesão vascular 1 (VCAM-1) e E-selectina. MÉTODOS: Examinou-se a expressão endotelial de ICAM-1, VCAM-1, E-selectina usando marcação imuno-histoquímica em secções de pulmão fixadas e parafinadas de lesões de GPA (n = 8 casos, 90 secções transversais de vasos analisados). Foram também analisados controles positivos: amostras de pulmão de doença intersticial associada à esclerodermia (SScl) (n = 8 casos, 96 secções transversais de vasos analisados) e controles negativos (n = 9 casos, 90 secções transversais de vasos analisados). A quantificação imuno-histoquímica foi realizada no aumento de 400x usando a técnica de point-counting. RESULTADOS: ICAM-1: A expressão endotelial mediana de ICAM-1 esteve aumentada de forma semelhante na GPA e na SScl (81% and 73%, respectivamente; p = 0.97). A comparação com o grupo controle (26.3%) revelou diferença estatisticamente significativa entre controle e GPA (p <0.001) quanto entre controle e SScl (p = 0.017). VCAM-1: A expressão mediana de VCAM-1 esteve significativamente aumentada na GPA se comparada a SScl (79.5% vs 41.4%; p = 0.012), no entanto, a expressão endotelial de VCAM-1 nos...

INTRODUCTION: Vascular and immunologic processes are central to the pathogenesis of granulomatosis with polyangiitis (GPA). Endothelial cellular adhesion molecules have a central role in recruiting leukocytes to sites of inflammation. Moreover, different vascular beds are phenotypically and functionally distinct with regard to expression of cellular adhesion molecules. They have been shown to be elevated in sera and in renal biopsies of patients with active ANCA-associated vasculitis. Despite of that, the expression of cellular adhesion molecules has not been studied in situ in the lungs. OBJECTIVE: Within this context, the aim of this study was to analyze the in situ pulmonary endothelial immunohistochemical pattern of expression of three cellular adhesion molecules in GPA: intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) and E-selectin . METHODS: For such, we examined formalin-fixed, paraffin-embedded sections of lung lesions of GPA (n = 8 cases, 90 transverse sections of pulmonary vessels), negative controls which were obtained from autopsies ( n = 9 cases, 90 transverse sections of pulmonary vessels analyzed) and positive controls which were cases of interstitial lung disease associated with systemic sclerosis (SScl) (n = 8 cases, 96 transverse sections of pulmonary vessels). The quantification of the immunohistochemical staining was performed at x400 magnification using the technique of point-counting, previously described. RESULTS: ICAM-1: Median endothelial expression of ICAM-1 was similarly enhanced in GPA and SScl (81% and 73%, respectively; p = 0.97). When compared to controls (26.3%), both GPA (p <0.001) and SScl (p = 0.017) had significantly higher endothelial expression of ICAM-1. VCAM-1: Median endothelial expression of VCAM-1 was significantly enhanced in GPA when compared to SScl (79.5% vs 41.4%; p = 0.012), however the endothelial expression of VCAM-1 in the controls was also moderately enhanced (49.8%)...

Babesia bovis: expression of adhesion molecules in bovine umbilical endothelial cells stimulated with plasma from infected cattle / Babesia bovis: expressão de moléculas de adesão em células endoteliais de cordão umbilical de bovinos estimuladas com plasma de bovinos infectados

Ten male, 12-month-old Jersey with intact spleens, serologically and parasitologically free from Babesia were housed individually in an arthropod-free isolation system from birth and throughout entire experiment. The animals were randomly divided into two groups. Five animals (group A) were intravenously inoculated with 6.6 X10(7) red blood cells parasitized with pathogenic sample of Babesia bovis (passage 7 BboUFV-1), for the subsequent "ex vivo" determination of the expression of adhesion molecules. Five non-inoculated animals (group B) were used as the negative control. The expression of the adhesion molecules ICAM-1, VCAM, PECAM-1 E-selectin and thrombospondin (TSP) was measured in bovine umbilical vein endothelial cells (BUVECs). The endothelial cells stimulated with a pool of plasma from animals infected with the BboUFV-1 7th passage sample had a much more intense immunostaining of ICAM-1, VCAM, PECAM-1 E-selectin and TSP, compared to the cells which did not received the stimulus. The results suggest that proinflammatory cytokines released in the acute phase of babesiosis may be involved in the expression of adhesion molecules thereby implicating them in the pathophysiology of babesiosis caused by B. bovis.

Dez bezerros machos, da raça Jersey, com 1 ano de idade com baços "in situ", sorológica e parasitologicamente livres de Babesia, foram mantidos em baias individuais no isolamento a prova de artrópodes do Depto de Veterinária desde o nascimento e ao longo de toda a experimentação. Os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos. Cinco animais (grupo A) foram inoculados por via intravenosa com 6,6 x10(7) hemácias parasitados com amostra patogênica de Babesia bovis (BboUFV - 1 7ª passagem) , para a determinação subseqüente "ex vivo" da expressão de moléculas de adesão . Cinco animais não inoculados (Grupo B ) foram utilizados como controlo negativo . A expressão de moléculas de adesão ICAM - 1, VCAM , PECAM - 1, E - selectina e trombospondina ( TSP ) foi medida em células endoteliais da veia umbilical de bovinos (BUVECs). As células endoteliais estimuladas com um pool de plasma proveniente de animais infectados com BboUFV - 1 7ª passagem tinham uma imunocoloração muito mais intensa de ICAM - 1 , VCAM , PECAM - 1 de E - selectina e de TSP , em comparação com as células que não receberam o estímulo . Os resultados sugerem que as citocinas pró-inflamatórias liberados na fase aguda da babesiose pode estar envolvida na expressão de moléculas de adesão , implicando , assim, elas na fisiopatologia da babesiose causada por B. bovis.

Aumento da imunorreatividade da molécula de adesão intercelular-1 na esclera e coroide em modelo experimental de hipercolesterolemia / Increased intercellular adhesion molecule-1 immunoreactivity in the sclera-choroid complex in hypercholesterolemia experimental model

Objetivo: O objetivo deste trabalho é avaliar a expressão da molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) na esclera e coroide de coelhos hipercolesterolêmicos. Métodos: Coelhos New Zealand foram organizados em dois grupos: GN (grupo dieta normal), composto por 8 coelhos (8 olhos), recebeu ração padrão para coelhos, durante 4 semanas; GH (grupo hipercolesterolêmico), composto por 13 coelhos (13 olhos), recebeu dieta rica em colesterol a 1% por 8 semanas. Foi realizada a dosagem sérica de colesterol total, triglicerídeos, HDL colesterol, glicemia de jejum no início do experimento e no momento da eutanásia. Ao final da 4ª semana para o GN e 8ª semana para o GH foi realizada a eutanásia dos animais. Os olhos foram corados com hematoxilina-eosina e submetidos à análise histológica, histomorfométrica e imunohistoquímica com o anticorpo ICAM-1. Resultados: Observou-se significativo aumento do colesterol total e triglicerídeos do GH em relação ao GN (p<0,001). A avaliação histológica com hematoxilina eosina revelou grande quantidade de macrófagos no complexo esclero-coroidal do GH. No GH constatou-se significativo aumento da espessura da esclera e coroide em relação ao GN (p<0,001). Houve significativo aumento da expressão da ICAM-1 na esclera e coroide dos animais do GH em relação ao GN (p<0,001). Conclusão: Este estudo demonstra que a dieta hipercolesterolêmica induz ao aumento da expressão da ICAM-1 na esclera e coroide de coelhos. .

Objective: The aim of this study is to investigate the expression of the intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) in the sclera and choroid of hypercholesterolemic rabbits Methods: New Zealand rabbits were divided into two groups: the normal diet group (NG), with 8 rabbits (8 eyes), was fed a standard rabbit diet for 4 weeks; the hypercholesterolemic group (HG), with 13 rabbits (13 eyes), was fed a 1% cholesterol- enriched diet for 8 weeks. Total serum cholesterol, triglyceride, HDL cholesterol and fasting blood glucose exams were performed at the start of the experiment and at the euthanasia time. HG and NG animals were euthanized after 8th week and 4th week, respectively. Their eyes were stained with hematoxylin-eosin and underwent histological, histomorphometric and immunohistochemical analyses with ICAM-1 antibody. Results: The diet has induced a significant increase in total cholesterol and triglyceride levels in HG when compared with NG (p<0.001). The histological analysis with hematoxylin-eosin revealed a large number of macrophages in the HG sclera-choroid complex. Moreover, a significant increase in the HG sclera and choroid thickness was observed in relation to NG (p<0.001). There was a significant increase in the ICAM-1 expression in HG sclera and choroid in relation to NG Conclusion: This study has revealed that the hypercholesterolemic diet induces an increase in the ICAM-1 expression in the rabbits’ sclera and choroid. .

Mecanismos moleculares da ação dos glicocorticóides endógenos e da anexina-A1 sobre o tráfego de neutrófilos: caracterização da ação sobre os eixos SDF-1α/CXCR4 e IL-17/IL-23/G-CSF / Molecular mechanisms of endogenous glucocorticoid and annexin-a1 actions on neutrophil traffic: characterization of this action on the SDF-1α/CXCR4 e IL-17/IL23/G-CSF axis

O tráfego de leucócitos é um processo complexo, dependente da ação de inúmeras substâncias químicas, além da perfeita interação celular. Desta forma, este estudo teve como objetivo avaliar a ação dos GCe e da ANXA1 sobre o eixo SDF-1α/CXCR4 e IL-17/IL-23/G-CSF e sobre a expressão de moléculas de adesão CD18, CD49d e CD62L. Foram utilizados camundongos machos Balb/C selvagens (WT) ou ANXA1-/-. As avaliações foram realizadas em condições basais, na presença de altas concentrações de GCe e na vigência de processo inflamatório, induzidos pela administração de ACTH (5 µg/animal, i.p.) ou pela injeção de LPS (100 µg/kg, i.p.), respectivamente, ou na ausência da ação dos GCe, pela ação do RU 38486 (RU, 10 mg/kg, i.p.). A participação da ANXA1 e do receptor FPR2 foi avaliada pelo pré-tratamento com Ac2-26 (1 mg/Kg, i.p.) ou com BOC2 (10 µg/animal, i.p.) durante 4 dias, 1 vez ao dia. A quantificação total e diferencial das células foi realizada em câmara de Neubauer e em esfregaços corados por May-Grunwald ou citometria de fluxo. As quantificações de CXCR2, CXCR4, FPR2, CD18, CD49d, CD62L e maturação granulocítica (CD11b/Ly6G) em células da medula e da circulação foram realizadas por citometria de fluxo. A expressão de ANXA1 nos tecidos do estomago e do baço foi realizada por western blotting e nas células da medula óssea e sangue circulante foi realizada por imunofluorescência. As quantificações de IL-17, IL-23, G-CSF, SDF-1α e corticosterona foram realizadas por ELISA. A quimiotaxia de neutrófilos da medula óssea e sangue periférico foi ensaiada na placa de quimiotaxia com filtro de poro de 8 µm. A fagocitose de neutrófilos apoptóticos por macrófagos da medula óssea foi avaliada por ensaio in vitro. Para verificar os efeitos do ACTH na migração de neutrófilos no processo inflamatório, foi empregado o modelo de bolsa de ar (100 µg/mL; LPS); e o comportamento dos leucócitos circulantes de animais tratados com ACTH foi avaliado pela técnica de microscopia intravital. Os resultados obtidos, que estão apresentados em quatro temáticas, mostraram que: 1) neutrófilos da medula óssea e sangue periférico expressam ANXA1 no citoplasma e membrana, bem como o receptor FPR2, constitutivamente, e a expressão de ambos é regulada pelos GCe. A ANXA1, via receptor FPR2 expresso em células da medula óssea, controlam a maturação neutrofílica e o tráfego destas células da medula óssea para o sangue. A ANXA1, via interação ao FPR2, controla o clearance de neutrófilos do sangue para a medula óssea, modulando o eixo SDF-1α/CXCR4; 2) A administração do ACTH causa neutrofilia e os neutrófilos circulantes são ANXA1+, CD18+, CD49d+, CD62L+, mostrando que injeção do ACTH in vivo altera o fenótipo destas células na circulação. Estas modificações alteram o comportamento dos neutrófilos na circulação, bem como a migração para a bolsa de ar na vigência de inflamação e para os tecidos de clearance. Estes efeitos podem ser dependentes, pelo menos em parte, da inibição de migração orientada, já que quimiotaxia frente ao fMLP ou ao SDF-1α estavam reduzidas. Ainda, o clearance de neutrófilos é reduzido em animais tratados com o ACTH pela menor atividade fagocítica e secretora dos macrófagos medulares; 3) Animais tratados com RU 38486 e ANXA1-/- mobilizam granulócitos da medula óssea para o sangue circulante e, deste compartimento para o foco de inflamação com maior intensidade que o observado em animais controles. O eixo IL-17/IL-23/G-CSF parece estar envolvido na granulopoiese e na mobilização de neutrófilos para o sangue durante a inflamação, mas não é alvo de ação da ANXA1 e o GCe nesta etapa do processo inflamatório. Adicionalmente, foi observado que na vigência de peritonite, as moléculas de adesão, CD49d e CD62L estão envolvidas no processo de migração de neutrófilos da medula óssea para o sangue. Os resultados aqui obtidos permitem concluir que os GCe e a ANXA1 são relevantes para granulopoiese e tráfego dos neutrófilos da medula óssea em condições fisiológicas e na vigência de processo inflamatório. Ainda, em conjunto com os dados da literatura, os nossos resultados podem sugerir a participação da ANXA1 dos GCe na plasticidade fenotípica dos neutrófilos de acordo com os estímulos a que são submetidos, e podem auxiliar na compreensão dos novos conceitos sobre a produção, tempo de vida, localização e funções de neutrófilos

The traffic leukocytes is a complex process dependent on the action of severals chemical mediators, in addition to perfect cell interaction. Therefore, this study aimed to evaluate the effect of GCe and ANXA1 on SDF-1α/CXCR4 and IL-17/IL-23/G-CSF and on the expression of adhesion molecules CD18, CD49d and CD62L. Balb/C wild type and ANXA1-/- male mice were employed. The analysis were performed at physiological conditions, in the presence of high concentrations of GCe and during of inflammatory process induced by ACTH administration (5 µg/animal, i.p.) or LPS injection (100 µg/kg, i.p.), respectively or in the absence of GCe action, by the action of RU 38486 (RU, 10 mg/kg , i.p.). The involvement of the receptor FPR2 and ANXA1 was assessed by pre-treatment with Ac2-26 (1 mg/kg, i.p.) or BOC2 (10 µg/animal, i.p.) for 4 days, once a day. The quantification of total and differential cell was performed in a Neubauer chamber and stained smears by May-Grunwald and flow cytometry. Quantification of expression of CXCR2, CXCR4, FPR2, CD18, CD49d, CD62L and granulocytic maturation (CD11b/Ly6G) in the bone marrow and circulation were performed by flow cytometry. The expression of ANXA1 on tissues was performed by western blotting and on cells from bone marrow and blood by immunocytochemistry. Quantification of IL-17, IL-23, G-CSF, SDF-1α and corticosterone were performed by ELISA. The chemotaxis of neutrophils from the bone marrow and blood was tested in the chemotaxis chamber with filter pore of 8 microns. The phagocytosis of apoptotic neutrophils by bone marrow macrophages was assessed by in vitro assay. To investigate the effects of ACTH in the migration of neutrophils in the inflammatory process, the model employed was air pouch (100 µg/ ml, LPS), and the behavior of circulating leukocytes from animals treated with ACTH were evaluated by intravital microscopy. The results obtained, which are presented in three sections, showed that: 1) neutrophils from the bone marrow and blood expressed ANXA1 in the cytoplasm and membrane, as well as FPR2, constitutively and the expression of both is regulated by GCe. The ANXA1 via FPR2 receptor expressed in bone marrow cells, controls the neutrophilic maturation and traffic of these cells from the bone marrow into the blood. The ANXA1 via interaction to FPR2 controls the clearance of neutrophils from the blood to the bone marrow by modulating the SDF-1α/CXCR4 axis; 2) the administration of ACTH induces neutrophilia and the circulating neutrophils are ANXA1+, CD18+, CD49d+ and CD62L+, showing that the injection of ACTH in vivo alters the phenotype of these cells in the blood. These modifications alter the behavior of neutrophils in the blood, as well as the migration to the air pouch in the presence of inflammation and to the tissue clearance, and these effects may be dependent, at least in part, on inhibition of migration oriented events, as chemotaxis in response to fMLP or SDF-1α were reduced. Further, the clearance of neutrophils is reduced in animals treated with ACTH due to the lower phagocytic and secretory activity of medullary macrophages; 3) Animals treated with RU 38486 and ANXA1-/- mobilize granulocytes from bone marrow into the blood, and from this compartment to the focus of inflammation with higher intensity than that observed in the control group. The axis IL-17/IL-23/G-CSF seems to be involved in granulopoiesis and mobilization of neutrophils into the blood during inflammation, but it is not the target of action of ANXA1 and GCe at this step of inflammatory process. Additionally, it was observed that in the presence of peritonitis, the adhesion molecules, CD49d and CD62L are involved in the migration of neutrophils from the bone marrow into the blood. The results obtained allow concluding that the GCe and ANXA1 are relevant to the granulopoiesis and the traffic of neutrophils from bone marrow under physiological conditions and in the presence of inflammation. Furthermore, together with literature data, the data presented here may suggest the involvement of ANXA1 the GCe in phenotypic plasticity of neutrophils according to the stimuli that are submitted, and may support to understand the new concepts of production, half-life, location and function of neutrophils

Papel de inibidores da síntese e absorção do colesterol na modulação de biomarcadores de inflamação e adesão celular in vivo e in vitro / Role of inhibitors of the cholesterol synthesis and absorption on modulation of inflammation and cell adhesion biomarkers in vivo and in vitro

O processo inflamatório tem um papel fundamental na gênese e desenvolvimento da aterosclerose, sendo que a disfunção endotelial é considerada um dos estágios iniciais da aterogênese. Por meio da inibição da enzima hidroxi-metil-glutaril coA redutase (HMGCR), as estatinas reduzem a biossíntese do colesterol e a formação de isoprenóides, produtos intermediários da síntese do colesterol que são importantes na modificação pós-transcricional de GTPases pequenas que estão envolvidas na disfunção endotelial e inflamação vascular. A ezetimiba é um inibidor da absorção do colesterol através da inibição da proteína NPC1L1. Com a finalidade de esclarecer os mecanismos moleculares da inibição da síntese e da absorção do colesterol sobre a modulação de biomarcadores inflamatórios e de adesão celular foram utilizados modelos in vitro com células endoteliais (HUVEC) e monócitos (células THP-1), e in vivo com células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de indivíduos hipercolesterolêmicos (HC). O efeito das estatinas, atorvastatina e sinvastatina, e da ezetimiba na expressão de RNAm e proteínas de moléculas de adesão endoteliais e moduladores do processo inflamatório, como citocinas e óxido nítrico (NO), foi estudado em células HUVEC. O efeito desses fármacos sobre a expressão de moléculas de adesão monocitárias foi estudado em células THP-1. O efeito da terapia hipolipemiante sobre essas moléculas foi também estudada em CMSP de HC tratados com ezetimiba (10 mg/dia/4 semanas), sinvastatina (10 mg/dia/8 semanas) e sinvastatina combinada com ezetimiba (10 mg de cada/dia/4 semanas). A expressão de RNAm foi avaliada por RT-qPCR. A expressão de moléculas de adesão na superfície de células THP-1 e HUVEC foi estudada por citometria de fluxo. A quantificação de citocinas secretadas no sobrenadante de células HUVEC e no plasma dos HC foi analisada pela tecnologia Milliplex. A quantificação do perfil lipífico, Proteína C reativa ultra-sensível (PCRus) e NO foi realizada por métodos laboratoriais convencionais. O papel do NO na modulação dos marcadores inflamatórios pelas estatinas foi também estudada, usando modelo de células HUVEC com NOS3 silenciado por interferência de RNAm e também por meio do uso do inibidor da síntese do óxido nítrico, L-NAME. Também foi avaliado o efeito de hipolipemiantes na expressão dos microRNAs (miRs) 221, miR-222 e miR-1303 em células HUVEC por meio do stem-loop RT-qPCR. O tratamento com atorvastatina e sinvastatina reduziu a expressão de RNAm e proteínas das moléculas de adesão LSelectina, PSGL-1 e VLA-4, em células THP-1 pré-tratadas com TNFα por 12 h. A ezetimiba reduziu a expressão de L-Selectina apenas no nível transcricional. Em células HUVEC, as estatinas diminuíram a expressão de RNAm de IL1B e SELP, entretanto aumentaram a de VCAM1. A ezetimiba reduziu a expressão de RNAm do IL1B. Entretanto as expressões de SELE, MMP9, IL6 e MMP9 não foram afetadas pelos tratamentos. A expressão das proteínas ICAM-1 e P-Selectina, na superfície de células HUVEC, foi diminuída pelo tratamento com as estatinas, mas não pela ezetimiba. Da mesma forma, a secreção das citocinas IL-6 e MCP-1 foram reduzidas pelas estatinas, entretanto a secreção de IL-8 não foi modificada por nenhum dos tratamentos. A expressão de NOS3 e a liberação de NO em células HUVEC foi aumentada pelas estatinas, porém não foi estimulada pela ezetimiba. Entretanto, os efeitos antiinflamatórios exercidos pelas estatinas foram independentes dessa via devido a que estes efeitos foram mantidos em células HUVEC com NOS3 silenciado por interferência de RNAm. Apesar de que o efeito sobre ICAM-1 e MCP-1 foi atenuado quando as células foram simultaneamente tratadas com L-NAME, os efeitos das estatinas parecem ser independentes da liberação de NO. As estatinas e a ezetimiba reduziram a expressão do miR-221, em células HUVEC. A expressão do miR-222 foi reduzida só pelo tratamento com atorvastatina. A expressão do miR-1303 não foi modulada pelos tratamentos hipolipemiantes. Em pacientes HC, a terapia de associação da sinvastatina e ezetimiba demonstrou melhorar o perfil lipídico de forma mais efetiva que ambas monoterapias. Da mesma forma, o tratamento combinado resultou em maior beneficio pela redução da expressão de RNAm em CMSP e da concentração plasmática das proteínas IL-1 ß, MCP-1, IL-8 e TNFα. A expressão de ICAM1 foi diminuída apenas no nível transcricional, entretanto a expressão de RNAm mas não da proteína do TNFα foi também reduzida pela sinvastatina em monoterapia. Não houve modulação de RNAm ou proteínas de outros marcadores estudados no modelo in vivo. Por outro lado, os efeitos anti-inflamatórios observados nos indivíduos HC foram independentes da modulação de PCRus e NO que não foram modificados pelos tratamentos hipolipemiantes. Neste estudo, foram confirmados os propostos efeitos pleiotrópicos das estatinas em modelos células de monócito e endotélio vascular in vitro e em pacientes HC. Por outro lado, apesar de ser menos potente que as estatinas foi mostrado que a inibição da absorção do colesterol tem também um efeito anti-inflamatório. A redução adicional do colesterol causado pela combinação das terapias hipolipemiantes outorga um maior beneficio cardiovascular em pacientes hipercolesterolêmicos

The inflammatory process has a key role in the genesis and development of atherosclerosis and the endothelial disfunction is considered as a first step in atherogenesis. By inhibiting the hydroxyl-methyl-glutaryl coA reductase (HMGCR)m statins reduce the cholesterol synthesis and isoprenoid generation, which are intermediary products of cholesterol synthesis with important role in posttranscriptional modifications of small GTPases that are involved in endothelial disfunction and vascular inflammation. The ezetimibe is an inhibitor of cholesterol absorption by inhibiting the NPC1L1 protein. To clarify the molecular mechanisms of the inhibition of cholesterol synthesis and absorption modulating inflammatory and cell adhesion biomarkers we used in vitro models of endothelial cells (HUVEC) and monocytes (THP-1), and an in vivo model of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from hypercholesterolemic (HC) patients. The effect of the statins, atorvastatin and simvastatin, and the ezetimibe on mRNA and protein expression of endothelial adhesion molecules and modulators of the inflammatory process, as citokynes and nitric oxide (NO), was analyzed in HUVEC. The effect of these drugs on the expression of monocyte adhesion molecules was also studied in THP-1. The influence of hypolipemiant therapy on the adhesion molecules was also analyzed in PBMC from HC treated with ezetimibe (10 mg/day/4-weeks), simvastatin (10 mg/day/8-weeks) and simvastatin combined with ezetimibe (10 mg each/day/4-weeks). The mRNA expression was evaluated by RT-qPCR. The expression of adhesion molecules on the surface of THP-1 and HUVEC cells was analyzed flow cytometry. The citokynes in the supernatants of HUVEC were quantified using the milliplex technology. The Lipid profile, high-sensivity PCR (hsPCR) and NO were determined by conventional laboratory methods. The role of the NO on the statin-modulation of inflammatory markers was also studied using a model with silenced NOS3 by interference of mRNA and by the use of the inhibitor of NO synthesis, L-NAME. The effect of hypolipemiants on the expression of microRNAs (miRs) 221, miR-222 and miR-1303 was also evaluated in HUVEC using the stem-loom RT-qPCR. Atorvastatin and simvastatin reduced the mRNA and protein expression of the adhesion molecules L-Selectin, PSGL-1 and VLA-4 in THP-1 cells pre-treated with TNFα for 12 h. The ezetimibe reduced the L-Selectin expression only at transcriptional level. In HUVEC, statins diminished IL1B and SELP mRNA expression, whereas VCAM1 was increased. The ezetimibe reduced the IL1B mRNA expression. However, SELE, MMP9, IL6 and MMP9 mRNA expressions were not affected by the treatments. The protein expression of ICAM-1 and P-Selectin on the surface of HUVEC was reduced by statins, but not by the ezetimibe. Similarly, IL-6 and MCP-1 secretion were reduced by statins, whereas IL-8 secretion was not modified by the treatments. The NO release and NOS3 expression in HUVEC was increased by the statins, however it was not stimulated by ezetimibe. Moreover, the anti-inflammatory statin effects were independent of this pathway due to statin effects were maintained in HUVEC with silenced NOS3. Although the statin effect on ICAM-1 and MCP-1 were attenuated by L-NAME co treatment, the statin effects seem to be independent of NO release. Statins and ezetimibe reduced miR221 in HUVEC. miR-222 expression was reduced only by atorvastatin. miR-1303 was not affected by the treatments. In HC patients, the improvement of the lipid profile simvastatin combined with ezetimibe was more efficient than both monotherapies. Similarly, the association therapy was better in reducing the mRNA expression in PBMC and plasma concentration of IL-1ß, MCP-1, IL-8 and TNFα. ICAM1 expression was reduced only at transcriptional level, whereas mRNA but not protein expression of TNFα was also reduced by the simvastatin monotherapy. There was no modulation mRNA or protein expression of other studied markers in the in vivo model. Additionally, the anti-inflammatory effects observed in the HC were independent of PCRus or NO modulation, which were not altered by the hypolipemiant treatments. In this study, the proposed plitropic effects of statins were confirmed in monocytes and endothelial cells in vitro and in HC patients. Moreover, although it was less potent than statins, an anti-inflammatory effect was also observed for the inhibition of cholesterol absorption. An additional reduction of the cholesterol caused by combined hypolipemiant therapies gives a greater cardiovascular beneffict in hypercholesterolemic patients

Avaliação das propriedades adesivas e inflamatórias das células endoteliais progenitoras circulantes de pacientes com anemia falciforme / Evaluation of adhesive and inflammatory properties in blood outgrowth endothelial cells from patients with sickle cell anemia

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The abstract is available with the full electronic document.

Oxidative stress and changes in the content and pattern of tissue expression of ß-catenin protein in diversion colitis

OBJECTIVE: The aim of this study is to verify if oxidative stress is related to changes in content and pattern of β-catenin protein expression in an experimental model of diversion colitis. METHODS: Sixty Wistar rats were submitted to intestinal bypass. The animals were divided into three groups according to the sacrifice to take place in six, 12 and 18 weeks. For each group, five animals only underwent laparotomy (control). The presence of colitis was diagnosed by histological study, and its severity, by inflammation grading scale. Cellular oxidative stress was measured by comet assay. Tissue expression of β-catenin protein was analyzed by the immunohistochemistry and quantification of its tissue content by computerized morphometry. Statistical analysis was performed with the Student's t-test, median, Mann-Whitney, ANOVA and Kruskal-Wallis, adopting a significance level of 5% (p <0.05). RESULTS: Colon segments without fecal stream developed colitis, which worsened with time of exclusion. Segments without fecal stream suffer higher levels of oxidative stress when compared to those with stream, and it worsens with time of exclusion. The levels of cellular oxidative stress are directly related to the degree of inflammation. The total content of ß-catenin in segments without fecal stream reduces after six weeks, and does not vary thereafter. The content of β-catenin in the apical portion of the colon crypts decreases with time, whereas in the basal region, it increases. The total content of ß-catenin is inversely related to the degree of inflammation and levels of tissue oxidative stress levels. CONCLUSION: There are changes in tissue content of E-cadherin and increased expression of ß-catenin in proliferative regions of colonic crypts, related with oxidative tissue stress. (AU)

OBJETIVO: O objetivo do presente estudo é avaliar a relação entre estresse oxidativo e conteúdo tecidual de β-catenina em modelo experimental de colite de exclusão. MÉTODOS: Sessenta ratos Wistar foram submetidos à derivação intestinal e divididos em três grupos experimentais segundo o sacrifício ser realizado em 6, 12 e 18 semanas. Para cada grupo, cinco animais foram submetidos apenas a laparotomia (controle). A colite foi diagnosticada por estudo histológico, enquanto sua intensidade por escala de graduação inflamatória. Os níveis de estresse oxidativo foram mensurados pelo ensaio cometa, enquanto a expressão e o conteúdo tecidual de ß-catenina por imunoistoquímica e morfometria computadorizada, respectivamente. Os resultados foram analisados pelos testes t de Student, Mann Whitney, ANOVA e Kruskal-Wallis, estabelecendo-se nível de significância de 5% (p<0,05). RESULTADOS: Nos segmentos sem trânsito fecal ocorre desenvolvimento de colite que piora com o tempo de exclusão. Segmentos sem trânsito sofrem maiores níveis de estresse oxidativo quando comparados àqueles com trânsito, piorando com o tempo de exclusão. Os níveis de estresse oxidativo encontram-se diretamente relacionados a piora da inflamação. O conteúdo total de ß-catenina no cólon sem trânsito reduz após seis semanas de exclusão. O conteúdo de ß-catenina no ápice das criptas cólicas diminui com o tempo, enquanto na região basal, aumenta. O conteúdo total da β-catenina encontra-se inversamente relacionado ao grau de inflamação e aos níveis de estresse oxidativo. CONCLUSÃO: Existe redução no conteúdo de ß-catenina, principalmente no ápice das glândulas cólicas e aumento nas regiões basais, relacionadas à piora do estresse oxidativo. (AU)

Efeitos dos ligantes de TSPO sobre a migração leucocitária: participação de receptores de glicorticóides / Effects of TSPO ligands on leukocyte migration: role of glucocorticoids receptors

Além dos receptores no sistema nervoso central (SNC), acoplados a receptores GABAA (CBR - central benzodiazepine receptor), outros sítios periféricos de ligação para os benzodiazepínicos (BDZ) foram descritos e denominados de "periféricos" (PBR peripheral benzodiazepine receptor) ou TSPO - Translocator protein. Sua função como modulador do sistema imune tem sido proposta, com a participação, pelo menos em parte, de glicocorticóides endógenos (GE). No entanto, os mecanismos da modulação dos TSPO sobre o processo inflamatório e a relação destes receptores com os GE ainda não estão totalmente estabelecidos. Desta forma, este trabalho visou investigar os efeitos de dois ligantes sintéticos de TSPO, um benzodiazepínico, Ro5-4864, e uma isoquinolona carboxamida, PK 11195, e suas relações com os GE, sobre os eventos da migração leucocitária. Para tanto, ratos Wistar machos foram tratados in vivo com RU 38486 (antagonista de receptor de GE) ou com veículo e, adicionalmente, os ligantes de TSPO, Ro5-4864 e/ou PK 11195, foram aplicados topicamente sobre a microcirculação do mesentério dos animais para avaliação do comportamento rolling e aderência de leucócitos, por microscopia intravital, em condições basais ou após estimulação pelo peptídeo formil-metionil-leucilfenilalanina (fMLP). Leucócitos periféricos foram coletados e tratados in vitro com os ligantes de TSPO para avaliação da expressão de moléculas de adesão, quimiotaxia e influxo de cálcio em condições basais ou após estimulação pelo fMLP. Ainda, culturas primárias de células endoteliais da microcirculação de ratos foram tratadas in vitro com os ligantes de TSPO para avaliação da expressão de moléculas de adesão em condições basais ou após estimulação pelo lipopolisacarídeo de E.coli (LPS). Os resultados obtidos mostraram que: 1) o ligante de TSPO, Ro5-4864, alterou a ação do fMLP, uma vez que inibiu a diminuição do rolling, o aumento de células aderentes, a clivagem de L-selectina, o aumento de expressão de PECAM-1 (platelet endothelial cell adhesion molecule), a quimiotaxia e o influxo de cálcio em neutrófilos; não afetou a expressão de PECAM-1 e ICAM-1 (intracellular cell adhesion molecule) induzida pelo LPS em células endoteliais; 2) o PK 11195 aumentou o influxo de cálcio e a quimiotaxia de neutrófilos induzido pelo fMLP; 3) a co-administração dos ligantes de TSPO, Ro5-4864 e PK 11195, reverteu os efeitos do Ro5-4864 sobre a expressão de L-selectina e PECAM-1, o influxo de cálcio e a quimiotaxia de neutrófilos. A possível inter-relação dos TSPO e GE foi verificada uma vez que o Ro5-4864 inibiu o aumento do número de leucócitos rolling e aderidos à parede vascular in vivo causado pelo tratamento com RU 38486; inibiu o aumento da expressão de L-selectina em neutrófilos e de ß2-integrina presente em linfócitos e de PECAM-1 em neutrófilos. Ainda, foi verificado que neutrófilos possuem expressões de TSPO maiores que linfócitos e células endoteliais e que esta expressão é aumentada em neutrófilos pela ação do fMLP. Em conjunto, os resultados obtidos neste trabalho sugerem que os ligantes de TSPO modulam diferentemente as funções de adesão e mobilidade de leucócitos e de adesão da célula endotelial e que uma relação alostérica de agonismo/antagonismo entre estes pode ser sugerida. Adicionalmente, os resultados mostram uma possível relação entre os TSPO e os receptores de citoplasmáticos de GE no controle da interação leucócito-endotélio

Besides central benzodiazepine receptor (CBR) found on central nervous system (CNS) coupled to GABAA, another binding site for benzodiazepines was described and named peripheral benzodiazepine receptor (PBR) or Translocator protein (TSPO). The mainly function described to this TSPO is steroidogenesis. Additionally, its function as an immune modulator has been proposed with the involvement, at least in part, of endogenous glucocorticoids (EG). However, mechanisms of TSPO modulation on inflammatory process and the relation between the receptor and EG has not been totally established. This study aimed investigates effects of two synthetic TSPO ligands, a benzodiazepine, Ro5-4864, and an isoquinoline carboxamide, PK 11195, and their relation with EG on leukocyte migration. For this purpose, male Wistar rats were in vivo treated with RU 38486 (EG antagonist receptor) or vehicle and, in addition, TSPO ligands, Ro5-4864 and/or PK 11195, were topically applied on animal mesentery microcirculation to evaluate leukocyte rolling and adhesion, by intravital microscopy, under basal conditions or after stimulation by N-formyl-methionine-leucine-phenylalanine (fMLP). In addition, peripheral leukocytes were collected and in vitro treated with TSPO ligands to evaluate adhesion molecules expression, chemotaxis and calcium influx. Endothelial cells obtained from cremaster muscle were in vitro treated with TSPO ligands to evaluate adhesion molecules expression under basal conditions or after stimulation by lipopolysaccharide from E.coli (LPS). Our results showed that: 1) TSPO ligand, Ro5-4864, altered the fMLP action since TSPO ligand inhibited the decrease of rolling, the increase of adherent cells, L-selectin cleavage, the increase of PECAM-1 expression, neutrophil chemotaxis and calcium influx; did not affect expression of PECAM-1 and ICAM-1 induced by LPS on endothelial cells; 2) PK 11195 increased fMLP-induced neutrophil calcium influx and chemotaxis; 3) co-administration of TSPO ligands, Ro5-4864 and PK 11195, reverted Ro5-4864 effects on L-selectin and PECAM-1 expression, neutrophil and calcium influx, as well as PECAM-1 and ICAM-1 expression on endothelial cells; 3) a possible inter-relation between TSPO and EG was observed since Ro5-4864 inhibited the increase of in vivo leukocyte rolling and adhesion induced by RU 38486 in vivo treatment; it inhibited the increase of neutrophil L-selectin, lymphocyte ß2-integrin and leukocyte PECAM-1 expressions; 4) It was showed that neutrophil have more TSPO than lymphocytes and endothelial cells, and this expression is increased by fMLP stimulation. Taken together, our results suggest that TSPO ligands differently modulate leukocyte adhesion and motility functions and endothelial cells adhesion, and further, they suggest an allosteric agonist/antagonist relation. Additionally, they showed a relation between TSPO and EG cytoplasmic receptor on the control of leukocyte-endothelial interaction

Endométrio na janela de implantação em mulheres com síndrome dos ovários policísticos / Endometrium in women with polycystic ovary syndrome during the window of implantation

O endométrio humano é submetido a uma complexa série de mudanças proliferativas e secretórias em cada ciclo menstrual e exibe somente pequeno período de receptividade, conhecido como "janela de implantação", necessário para a nidação do blastocisto no útero. O processo da implantação ocorre de forma sequencial, levando ao estabelecimento da gravidez. Alterações morfofuncionais durante este período podem impedir ou dificultar a implantação. Por este motivo, o estudo do endométrio nesta fase é importante para o aprimoramento de terapias que possam interferir nos mecanismos envolvidos na interção materno-embrionária. Várias doenças ginecológicas, incluindo a síndrome dos ovários policísticos (SOP), estão associadas à diminuição da fecundidade e da receptividade uterinas. Apesar de recentes avanços nas técnicas de reprodução assistida, permitindo a seleção de embriões de alta qualidade, a taxa de implantação continua baixa e não tem aumentado suficientemente nas últimas décadas. O presente artigo tem como objetivo revisar os aspectos endometriais da "janela de implantação" em mulheres com a síndrome dos ovários policísticos, focando especialmente as moléculas de adesão. Para tanto, nos valemos da análise de 105 artigos publicados em revistas indexadas no PUBMED nos últimos 50 anos (até maio de 2011). Como conclusão, a receptividade endometrial parece ser o maior fator limitante no estabelecimento da gestação em grande número de doenças ginecológicas, incluindo a SOP, e o tratamento para melhorar as taxas de implantação possivelmente será nessa direção.

The human endometrium undergoes to a complex series of prolifertive and secretory changes in each menstrual cycle and displays only a short period of receptivity, known as the "window of implantation", necessary for the implantation of the blastocyst in the uterus. The implantation process occurs in a sequential manner, leading to the establishment of pregnancy. Morphofunctional changes during this period may prevent or hinder the implantation. For this reason, the study of the endometrium at this stage is important for the improvement of therapies that may interfere with the mechanisms involved in maternal-embryonic interaction. Several gynecological disorders, including polycystic ovary syndrome (PCOS), are associated with decreased fertility and uterine receptivity. In spite of recent advances in assisted reproduction techniques, allowing the selection of high quality embryos, the implantation rate remains low and has not increased enough in recent decades. This article aims at reviewing the endometrial aspects of the "window of implantation" in women with polycystic ovary syndrome, focusing mainly on adhesion molecules. For that purpose, we analyzed 105 articles published in journals indexed in PubMed in the last 50 years (up to May 2011). In conclusion, the endometrial receptivity seems to be the major limiting factor for the establishment of pregnancy in a large number of gynecological diseases, including PCOS, and treatment to improve implantation rates is likely to be taken towards this direction.

Citoesqueleto e mecanotransdução na fisiopatologia da lesão pulmonar induzida por ventilador / Cytoskeleton and mechanotransduction in the pathophysiology of ventilator-induced lung injury

A ventilação mecânica é uma terapia importante, mas pode resultar em complicações. Uma das mais relevantes é a lesão pulmonar induzida por ventilador. Devido à hiperdistensão alveolar, o pulmão inicia um processo inflamatório, com infiltrado neutrofílico, formação de membrana hialina, fibrogênese e prejuízo de troca gasosa. Nesse processo, a mecanotransdução da hiperdistensão celular é mediada através do citoesqueleto da célula e de suas interações com a matriz extracelular e com as células vizinhas, de modo que o estímulo mecânico da ventilação se traduz em sinalização bioquímica intracelular, desencadeando ativação endotelial, permeabilidade vascular pulmonar, quimiotaxia leucocitária, produção de citocinas e, possivelmente, lesão de órgãos à distância. Estudos clínicos demonstram essa relação entre distensão pulmonar e mortalidade em pacientes com lesão pulmonar induzida por ventilador. Entretanto, apesar de o citoesqueleto ter um papel fundamental na patogênese da lesão pulmonar induzida por ventilador, a literatura carece de estudos utilizando modelos in vivo sobre as alterações do citoesqueleto e de suas proteínas associadas durante esse processo patológico.

Although mechanical ventilation is an important therapy, it can result in complications. One major complication is ventilator-induced lung injury, which is caused by alveolar hyperdistension, leading to an inflammatory process, with neutrophilic infiltration, hyaline membrane formation, fibrogenesis and impaired gas exchange. In this process, cellular mechanotransduction of the overstretching stimulus is mediated by means of the cytoskeleton and its cell-cell and cell-extracellular matrix interactions, in such a way that the mechanical stimulus of ventilation is translated into an intracellular biochemical signal, inducing endothelial activation, pulmonary vascular permeability, leukocyte chemotaxis, cytokine production and, possibly, distal organ failure. Clinical studies have shown the relationship between pulmonary distension and mortality in patients with ventilator-induced lung injury. However, although the cytoskeleton plays a fundamental role in the pathogenesis of ventilator-induced lung injury, there have been few in vivo studies of alterations in the cytoskeleton and in cytoskeleton-associated proteins during this pathological process.

Mecanismos celulares e moleculares de ação dos glicocorticóides endógenos sobre a mobilização de neutrófilos / Cellular and molecular mechanisms of action of endogenous glucocorticoids on the neutrophil mobilization

Temos mostrado que os glicocorticóides endógenos (GE) modulam o rolling e a aderência de neutrófilos in vivo, mediando a expressão de moléculas de adesão no leucócito e no endotélio. Adicionalmente, os GE controlam a maturação neutrofílica na medula e a sua mobilização para o sangue periférico. O presente trabalho visou investigar os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na modulação exercida pelos GE neste processo. Utilizando ratos Wistar submetidos à adrenalectomia bilateral, tratados com RU 38486 ou controles (falso-operados, tratados com veículo ou não manipulados), foi demonstrado que: 1) os GE controlam, negativamente, a expressão de L-selectina em neutrófilos circulantes e ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1, VAP-1 na célula endotelial e, positivamente, a expressão de L-selectina em granulócitos da medula óssea via seu receptor citosólico (GCR); 2) o mecanismo envolvido no controle dos GE sobre a expressão de L-selectina é independente de ação sobre sua expressão gênica ou da atividade de NFkB, mas dependente da expressão de anexina-A1, como verificado em camundongos knockouts (KO) para esta proteína 3) o controle da expressão de moléculas de adesão endotelial é dependente de ações sobre a expressão gênica, via translocação nuclear do NFkB; 4) a neutrofilia detectada em animais adrenalectomizados (ADR) é mediada pelo GCR, e dependente de anexina- A1; 5) a neutrofilia parece ser dependente da ação da anexina-A1 sobre a secreção de SDF-1 na medula óssea e expressão de CXCR-4 em neutrófilos circulantes e da medula; 6) concentrações circulantes elevadas de GE induzidas pela administração de ACTH confirmaram o controle dos GE, via anexina A-1, sobre o tráfego de neutrófilos da medula óssea para o sangue, mas sugerem um controle diferencial dos GE e anexina A-1 sobre a expressão de L-selectina em células da medula e do sangue circulante. Estes dados mostram mecanismos inéditos do controle dos GE sobre o tráfego de neutrófilos, que diferem em cada microambiente...

We have shown that endogenous glucocorticoids (GE) modulate the rolling and adhesion of neutrophils in vivo, mediating the expression of adhesion molecules on leukocytes and the endothelium. Additionally, the GE control neutrophil maturation in bone marrow and mobilization to peripheral blood. This work aimed to investigate the molecular and cellular mechanisms involved in the modulation exerted by GE in this process. Using male Wistar rats, submitted to bilateral adrenalectomy, treatment with RU 38 486 or controls (sham operated, vehicle or non manipulated), it was shown that: 1) GE control, negatively, L-selectin expression on circulating neutrophils and ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1, VAP-1 on endothelial cell and, positively, L-selectin expression on bone marrow granulocytes via their cytosolic receptor (GCR); 2) the mechanism involved in the control of GE on the L-selectin expression is independent of its action on gene expression or NFkB activity, but dependent on the expression of anexina-A1, as observed in mice knockouts for this protein; 3) the control of endothelial adhesion molecules is dependent on gene expression, via NFkB translocation; 4) the neutrophilia detected in adrenalectomized animals (ADR) is mediated by GCR, and dependent on anexina-A1; 5) the neutrophilia seems to be dependent on the action of annexin A-1 on SDF-1á secretion in bone marrow and expression of CXCR-4 in peripheral blood and bone marrow; 6) high circulating concentrations of GE induced by administration of ACTH confirmed the control of GE, via the annexin-1, on the traffic of neutrophils from the bone marrow to the blood, but suggest a differential control of GE and annexin A-1 on the L-selectin expression in the bone marrow and circulating blood. These data indicate unpublished mechanisms of control of GE on the traffic of neutrophils, which differ in each microenvironment and cell type involved in this complex phenomenon.

Análise da expressão de moléculas de adesão no tumor primário e em metástases ósseas e linfonodais de pacientes com câncer de próstata / Adhesion molecules in localized prostate cancer and in bone and lymph node metastases

Objetivo: As moléculas de adesão celular (MAC) são essenciais para a manutenção do fenótipo epitelial. Alguns estudos têm relatado associação entre as alterações de sua expressão e a carcinogênese, mas o seu papel no câncer de próstata não é claro. Nosso objetivo foi estudar o perfil de expressão de E-caderina, cateninas e integrinas em espécimes cirúrgicos de câncer de próstata e associar as suas expressões com a evolução do tumor. Avaliamos também o perfil de expressão em metástases ósseas e linfonodais, a fim de compreender a influência destes marcadores na progressão do câncer de próstata. Materiais e Métodos: Foram selecionados 111 pacientes com câncer de próstata localizado tratados com prostatectomia radical pelo mesmo cirurgião. Sessenta pacientes não apresentaram recidiva tumoral após acompanhamento médio de 123 meses. A expressão das MAC foi avaliada por imuno-histoquímica (IH) em microarranjo tecidual (TMA), contendo duas amostras de cada tumor. Empregamos análise semiquantitativa para avaliação da expressão e determinamos a associação entre a expressão de cada MAC com a recorrência do tumor após a cirurgia. Avaliamos também a expressão das MAC por IH em TMA contendo espécimes de 28 metástases ósseas e em outro TMA contendo 19 metástases linfonodais com seus 19 tumores primários correspondentes. Resultados: Nos tumores primários a análise multivariada mostrou que a expressão das integrinas 3 e 3 1 relaciona-se com recidiva da doença. Quando a expressão de 3 foi forte e a expressão de 3 1 foi positiva, as chances de recorrência foram de 3,0 e 2,5 vezes maior. Apenas 19% e 28% dos pacientes estavam livres de recidiva após seguimento médio de 123 meses, quando os tumores apresentavam forte imunoexpressão de 3 ou positiva para 3 1 respectivamente. Outras integrinas apresentaram expressão reduzida, exceto 6 que foi expressa pela maioria dos tumores primário e metástases. A E-Caderina e as cateninas não mostraram associação com o prognóstico no tumor...

Purpose: Cell adhesion molecules (CAM) are essential for the maintenance of epithelial phenotype. Some studies have reported correlations between abnormalities in their expression and carcinogenesis, but their role in prostate cancer is unclear. Our aim was to study the expression profile of E-cadherin, catenins and integrins in surgical specimens of prostate cancer and associate their expression with outcome. We also assessed these expressions in bone and lymph node metastases in order to understand their influence in the progression of prostate cancer. Materials and Methods: We selected 111 patients with localized prostate cancer who underwent radical prostatectomy performed by the same surgeon. Sixty patients had no tumor recurrence after a median follow-up of 123 months. The CAM expression was evaluated by immunohistochemistry in a tissue microarray (TMA) containing two samples of each tumor. A semiquantitative analysis was employed and we measured the association between the expression of CAM and tumor recurrence. We also evaluated CAM expression by immunohistochemistry in a TMA containing 28 bone metastases and in other TMA containing 19 lymph node metastases with their corresponding 19 primary tumors. Results: In primary tumors, multivariate analysis showed that expression of 3 and 31 integrins was related to worse outcome. When 3 expression was strong and 31 expression was positive,the odds of recurrence were 3.0 and 2.5 fold higher. Only 19% and 28% of patients were recurrence-free in a mean follow up period of 123 months, when tumors showed strong 3 or positive 31 immuno-expression respectively. Other integrins have shown reduced expression, except 6 , which was expressed in most primary and metastatic cases. E-cadherin and catenins expressions were not associated with primary tumor outcome. At the metastatic setting, there was a global loss of CAM expression. We observed reliable gain of expression with prostate cancer progression...

Transmigração endotelial do fungo patogênico Sporothrix schenckii: modulação da via de p38MAPK/MLCK, Src e de moléculas de adesão celular / Endothelial transmigration of the pathogenic fungus, Sporothrix schenckii: pathway modulation of p38MAPK/MLCK, Src and cell adhesion molecules

Sporothrix schenckii é um fungo dimórfico, agente etiológico da esporotricose, uma micose subaguda ou crônica que pode eventualmente evoluir para complicações sistêmicas, principalmente em pacientes imunocomprometidos. O endotélio exerce um papel crucial durante infecções disseminadas já que, juntamente com as células epiteliais, representa uma barreira a ser ultrapassada por microorganismos invasores. Em estudos anteriores, observamos que S. schenckii transmigra preferencialmente pela rota paracelular (passagem entre células endoteliais adjacentes), interagindo em seguida com componenetes da matriz subendotelial. Também foram identificadas algumas vias de sinalização relacionadas à diferentes fases da interação de leveduras de S. schenckii com o endotélio in vitro (associação/endocitose, transmigração). No entanto, a correlação entre tais vias de sinalização e os mecanismos celulares da invasão do endotélio pelo fungo não foram efetivamente demonstrados. No presente trabalho, a análise do perfil de proteínas endoteliais totais fosforiladas em resíduos de tirosina mostrou que S. schenckii induz fosforilações em tempos curtos (< 15 minutos), em proteínas de massas moleculares 20, 13, 12 e 6KDa, enquanto alunas proteínas de mais alto peso molecular (83, 123, 136, 140 e 193 KDa) persistem fosforiladas em tempos mais longos durante a infecção (6 horas). As vias de transdução de sinais disparadas pela interação do fungo com o endotélio foram investigadas através do uso de inibidores da ativação de MAPKs p38 (SB 203580) e ERK (PD 98059), MLCK (W7) e de um quelante de Ca2+ intracelular (BAPTA). A transmigração de S. schenckii através de monocamadas de HUVECs por 6 horas mostrou ser dependente da ativação de ERK e p38, ions Ca2+ intracelular e MLCK. Estas vias estão também envolvidas nos rearranjos do citoesqueleto de actina que levam à contratilidade celular e aumento da permeabilidade endotelial. A interação do fungo com HUVECs induziu ativação de Src...

Sporothrix schenckii, a dimorphic fungus, is the causative agent of sporotrichosis, a cutaneous/subcutaneous mycosis which can eventually evolve to systemic complications, mainly in immunocompromised patients. The primary interaction of pathogenic fungi with endothelial cells (EC) is throught to be essential for the development of systemic infections. We have previously shown that S. schenckii cross endothelial monolayers through a paracellular pathway, in a process also modulated by the subendothelial matrix, and that the fungus is able to alter host signaling pathways. We observed that the interaction of S. schenckii with human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was regulated by tyrosine-phosphorylation of EC proteins. In the present work, we observed that S. schenckii stimulates the early increase (<15 minutes) in tyrosine-phorphorylation of 20, 13, 12 e 6 KDa endothelial proteins, whereas tyrosine-phosphorylation of higher molecular weight proteins (83, 123, 136, 140 e 193 KDa) persists up to 6 hours of endothelial infection. Selective signal transduction inhibitors (SB203580 and W7, for blocking p38 MAPK and MLCK activation, respectively) were able to inhibit transendothelial migration of S. schenckii. The process was also modulated by Ca++ions. These signaling pathways are crucial for the actin rearrangement associated to impairment of endothelial permeability. Long-term (3 hours) interaction of S. schenckii with HUVECs lead to increase of MLC2 phosphorylation and Src activation. Src was shown by others to be involved in the phosphorylation of VE-cadherin, thus provoking adherent junctions (AJs) disassembly. We found that S. schenckii induces tyrosine-phosphorylation of endothelial VE-cadherin up to 3 hours of interaction with endothelial cells. VE-cadherin phosphorylation can be triggered by the activation of E-selectin in endothelial cells. Since the time-course of the major signaling events correlated with the time needed...

Differentiation syndrome in acute promyelocytic leukemia: pathogenesis and risk factors / Síndrome da diferenciação na leucemia promielocítica aguda: patogênese e fatores de risco

Differentiation syndrome is a treatment complication which can occur in acute promyelocytic leukemia (APL) patients treated with all-trans retinoic acid (ATRA) or arsenic trioxide (ATO), which is characterized by enhanced leukocyte transmigration. Several cellular and molecular mechanisms participate in differentiation syndrome development. This review discusses the changes in expression of adhesion molecules induced during ATRA and ATO treatments and their possible implications in the pathogenesis of this potentially fatal complication.

A síndrome da diferenciação (DS) é um efeito colateral que pode ocorrer em pacientes com leucemia promielocítica aguda (APL) tratados com ácido all-trans-retinóico (ATRA) ou trióxido de arsênico (ATO), sendo caracterizada pelo aumento da transmigração de leucócitos. Vários mecanismos celulares e moleculares participam no desenvolvimento da DS. Esta revisão discute as mudanças na expressão de moléculas de adesão induzidas durante o tratamento com ATRA e ATO e possíveis implicações na patogênese desta complicação potencialmente fatal.