Advanced glycation end-products (AGEs) accumulation in skin: relations with chronic kidney disease-mineral and bone disorder / Acúmulo dos produtos finais da glicação avançada (AGEs) na pele: relações com o distúrbio mineral e ósseo na doença renal crônica

Abstract Introduction: Chronic kidney disease (CKD) is associated with high morbidity and mortality rates, main causes related with cardiovascular disease (CVD) and bone mineral disorder (CKD-BMD). Uremic toxins, as advanced glycation end products (AGEs), are non-traditional cardiovascular risk factor and play a role on development of CKD-BMD in CKD. The measurement of skin autofluorescence (sAF) is a noninvasive method to assess the level of AGEs in tissue, validated in CKD patients. Objective: The aim of this study is analyze AGEs measured by sAF levels (AGEs-sAF) and its relations with CVD and BMD parameters in HD patients. Methods: Twenty prevalent HD patients (HD group) and healthy subjects (Control group, n = 24), performed biochemical tests and measurements of anthropometric parameters and AGEs-sAF. In addition, HD group performed measurement of intact parathormone (iPTH), transthoracic echocardiogram and radiographies of pelvis and hands for vascular calcification score. Results: AGEs-sAF levels are elevated both in HD and control subjects ranged according to the age, although higher at HD than control group. Single high-flux HD session does not affect AGEs-sAF levels. AGEs-sAF levels were not related to ventricular mass, interventricular septum or vascular calcification in HD group. AGEs-sAF levels were negatively associated with serum iPTH levels. Conclusion: Our study detected a negative correlation of AGEs-sAF with serum iPTH, suggesting a role of AGEs on the pathophysiology of bone disease in HD prevalent patients. The nature of this relation and the clinical application of this non-invasive methodology for evaluation AGEs deposition must be confirmed and clarified in future studies.

Resumo Introdução: A doença renal crônica (DRC) apresenta elevadas taxas de morbidade e mortalidade, sendo a doença cardiovascular (DCV) e o distúrbio mineral e ósseo da DRC (DMO-DRC) complicações frequentes. As toxinas urêmicas, dentre elas os produtos finais da glicação avançada (AGEs), são fatores de risco cardiovascular não tradicionais e se encontram envolvidas no desenvolvimento do DMO-DRC na DRC. A medida da autofluorescência da pele (sAF) é método não invasivo para quantificação do acúmulo tecidual de AGEs validado em pacientes portadores de DRC. Objetivos: O objetivo deste estudo é avaliar as relações entre os AGEs medidos por sAF (AGEs-AF) e parâmetros de DCV e DMO-DRC em pacientes em hemodiálise (HD). Métodos: 20 pacientes em HD (grupo HD) e 24 indivíduos hígidos (grupo controle) foram submetidos à análise bioquímica sérica, medidas antropométricas e de sAF. O grupo HD realizou medida de hormônio intacto da paratireoide (PTHi), ecocardiograma transtorácico e radiografias de pelve e mãos para pesquisa de calcificação vascular. Resultados: Os níveis de AGEs-sAF foram elevados para a idade nos grupos HD e controle, porém mais elevados no grupo HD. Sessão única de HD de alto-fluxo não afetou os níveis de AGEs-sAF. Os níveis teciduais de AGEs não se correlacionaram com massa ventricular, espessura de septo interventricular ou calcificação vascular no grupo HD. Os níveis de AGEs-sAF se correlacionaram negativamente com os níveis séricos de PTHi. Conclusão: Nosso estudo detectou correlação negativa entre os níveis de AGEs-sAF e os níveis séricos de PTHi, sugerindo que os AGEs estejam envolvidos na fiosiopatologia da doença óssea em pacientes em HD. A natureza desta relação e a aplicação clínica deste método não invasivo de avaliação do acúmulo tecidual de AGEs deve ser confirmada e elucidada por estudos futuros.

Modulação da proliferação, apoptose e autofagia de linfocitos T por RAGE / Modulation of proliferation, apoptosis and autophagy of T lymphocytes by RAGE

RAGE (Receptor for advanced glycation endproducts) é um receptor de padrões moleculares (PRR) reconhecido principalmente por seu envolvimento na patogênese de complicações secundárias do Diabetes Mellitus. Sua ativação está relacionada à modulação da resposta imune-inflamatória, promovendo ativação, migração e maturação de leucócitos; e induzindo a liberação de citocinas inflamatórias. A sinalização via RAGE também está relacionada à regulação dos processos de sobrevivência, apoptose e autofagia celular. Pouco se sabe sobre o papel de RAGE na regulação desses processos em células da resposta imune adaptativa e, especificamente, em linfócitos T. Nosso objetivo foi avaliar a influência da ativação de RAGE na biologia de células T. Para isso, observamos seus efeitos na modulação da proliferação, apoptose e autofagia, e a contribuição da ativação de NF-κB na indução desses processos. Células de linhagem de linfócitos T (JM/Jurkat) foram estimuladas com os ligantes de RAGE BSA-AGE (100 e 200 µg/mL) e S100b (10 µg/mL). A estimulação também foi realizada mediante a pré-ativação do receptor de células T (TCR). Experimentos de ganho de função foram realizados por meio da transfecção transitória das células com um vetor plasmidial de RAGE. A proliferação celular foi determinada por ensaio de exclusão com azul de Trypan. A apoptose foi avaliada através da detecção da fragmentação do DNA pelo método TUNEL e da expressão de p53, Bax e Bcl-2 por Western blot. Ainda por Western blot, observamos a expressão de proteínas características do processo de autofagia, p62 e LC3; e de p50, subunidade do fator de transcrição NF-κB. O estímulo com BSAAGE e S100b não alterou a proliferação e a viabilidade, mas, em células transfectadas, esse estímulo tendeu a aumentar a proliferação e a viabilidade, sobretudo após a pré-ativação das células. O BSA-AGE e o S100b produziram efeitos distintos sobre a apoptose a depender da pré-ativação e do período experimental avaliado. O estímulo com os agonistas de RAGE atenuaram a inibição de LC3 e p53 induzida pela camptotecina. Efeito de "resgate" semelhante foi verificado na expressão de p50. O estímulo de RAGE parece favorecer a proliferação e a autofagia de linfócitos T. Os seus efeitos sobre a apoptose variam de acordo com o tipo, concentração e período de exposição ao ligante utilizado

RAGE (Receptor for advanced glycation endproducts) is a pattern recognition receptor (PRR) that is especially recognized for its involvement in the pathogenesis of secondary complications of Diabetes Mellitus. Its activation is related to the modulation of immune-inflammatory responses, by promoting activation, maturation and migration of leukocytes, as well as the induction of inflammatory cytokines. RAGE signaling is also related to the regulation of cellular processes like survival, apoptosis and autophagy. Little is known about the role of RAGE in the regulation of these processes in cells of the adaptive immune response, specifically in T lymphocytes. Our main purpose was to evaluate the influence of RAGE activation in T cell biology. We observed the role of this receptor in the modulation of proliferation, apoptosis and autophagy, and the contribution of NF-kB in the induction of these processes. A human cell line of T lymphocytes (JM/ Jurkat) were stimulated with the RAGE ligands: BSA-AGE (100 and 200 µg/mL) and S100B (10 µg/mL). The stimulation was also performed after pre-activation of the T cell receptor (TCR). Gain of function experiments were performed by transient transfection of cells with a plasmid vector to increase RAGE expression. Cell proliferation was determined by Trypan blue dye exclusion assay. Apoptosis was assessed by the detection of DNA fragmentation by the TUNEL method, and p53, Bax and Bcl-2 expression by Western blotting. Also by Western blotting, we observed the effect of RAGE on the expression of autophagy-related proteins, p62 and LC3, and on the expression of p50, subunit of the transcription factor, NF-κB. The stimulation with BSA- AGE and S100b did not alter the proliferation and viability, but, in transfected cells, this stimulation tended to increase proliferation and viability, especially after the cell pre-activation. BSA-AGE and S100b had distinct effects on apoptosis depending on the cell pre-activation and trial period evaluated. The stimulation with agonists of RAGE attenuated the inhibition of LC3 and p53 induced by camptothecin. Similar effect was observed in the expression of p50. The stimulation of RAGE seems to favor the proliferation and autophagy of T lymphocytes. Its effects on apoptosis may vary according to the type, concentration and period of exposure to the ligand used

Papel de RAGE e TLR4 na modulação da resposta imune inflamatória em PBMC de pacientes diabéticos e não diabéticos: (estudo in vitro) / Role of RAGE and TLR4 in modulation of inflammatory immune response in PBMC of diabetic and non-diabetic individuals. (In vitro study)

Diabetes mellitus se caracteriza pelo acúmulo de produtos finais da glicação avançada (AGEs) que ativam seu receptor RAGE. Entre as complicações associadas ao diabetes está a modulação da resposta imune, evidenciada pela maior susceptibilidade à infecção em diabéticos. O sistema imune percebe e reaje aos microrganismos por meio de receptores de padrões moleculares (receptores semelhantes à Toll, TLRs). Lipopolissacarídeo da parede celular (LPS) é um dos principais fatores de virulência de microrganismos Gramnegativos e é reconhecido principalmente por TLR4. A hipótese deste trabalho é que a ativação de RAGE e TLR4 por seus ligantes pode resultar em efeito sinérgico na modulação da proliferação, morte celular e expressão de citocinas inflamatórias por células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Foram selecionados 7 indivíduos não diabéticos e 6 indivíduos portadores de diabetes tipo 2 para coleta de PBMCs. Estas células foram estimuladas com LPS bacteriano e BSA glicado, isoladamente e combinados, na presença e na ausência de inibidores dos receptores RAGE e TLR4. Proliferação e morte celular foram avaliadas por contagem direta em hemocitômetro e citometria de fluxo, respectivamente. A expressão de citocinas e quimiocinas inflamatórias foi avaliada por RT-qPCR, enquanto a modulação do padrão de resposta imune adaptativa foi estudada por meio de citometria de fluxo. Os resultados mostram que PBMCs de pacientes portadores de diabetes tendem a ser mais resistentes à indução de morte celular. De um modo geral, a inibição dos receptores RAGE e TLR4 não interfere na atividade metabólica e viabilidade celular em diabéticos e não diabéticos. A expressão gênica de CCL3 e CCR5 não foi regulada pelos receptores RAGE e TLR, sendo discretamente mais elevada em pacientes não diabéticos. A expressão de TNF-I e IL-10 foi regulada por TLR, enquanto a expressão de RAGE foi regulada de forma autócrina pela ativação do próprio RAGE. Observamos uma tendência para maior quantidade de linfócitos T auxiliares em pacientes portadores de diabetes, com desvio para um padrão de resposta Th1. Em geral, PBMCs de diabéticos parecem ser mais resistentes á morte celular e mais responsivas aos estímulos avaliados. Concluímos que não houve sinergismo entre RAGE e TLR na modulação da resposta de PBMC de indivíduos diabéticos e não diabéticos

Diabetes mellitus is characterized by the progressive accumulation of advanced glycation end-products (AGEs), which bind and activate their membrane-bound receptor (RAGE) on a variety of target cells. Modulation of the immune response is one of the diabetes-associated complications and is reflected on the increased susceptibility of diabetes patients to infections and sepsis. The immune system senses and reacts to microorganisms by pattern-recognition receptors, such as Toll-like receptors (TLRs). Bacterial lipopolysaccharide (LPS) is a major virulence factor of Gram-negative microorganisms, which is recognized mainly by TLR4. The hypothesis of this study is that of a synergism between activated TLR4 and RAGE that modulates the response of cells of innate and adaptive immunity in the circulation (peripheral blood monocytic cells, PBMCs). PBMCs were collected from 13 volunteers (7 with type 2 diabetes and 6 systemically-healthy controls). The cells were stimulated with bacterial LPS and glycated bovine serum albumin (AGE-BSA), both independently and in association. To study the role of TLR4 and RAGE signaling, these stimulations were performed in the presence and absence of specific inhibitors of RAGE and TLR4. We used direct counting in a hemocytometer and flow cytometry, respectively, to assess cell proliferation and death. The expression of selected cytokines and receptors was studied by RTqPCR, whereas the effect of these stimuli on the modulation of T helper-type response was determined by flow cytometry. We observed increased cell survival in PBMCs from diabetic patients. Inhibition of RAGE and TLR4 had no marked effect on cell proliferation, metabolic activity and survival. Gene expression of CCL3 (MIP-1alpha) and CCR5 was discretely higher in PBMCs from non-diabetic patients and was not affected by RAGE or TLR4 signaling. Expression of TNF-α and IL-10 was regulated by TLR, whereas RAGE gene expression was regulated in autocrine fashion by activation of the RAGE receptor. A greater proportion of CD4+ lymphocytes was observed in diabetic patients, which also showed a trend toward a shift to Th1-response. Overall, PBMC from diabetes patients were more resistant to apoptosis and less responsive to the TLR4 and RAGE ligands used. We conclude that there is no synergism between TLR4 and RAGE on the modulation of PBMC cell proliferation, apoptosis and gene expression

Modulação da proliferação, morte celular e expressão gênica de mediadores inflamatórios pela ativação de RAGE e TLR4 em células da resposta imune inata e adaptativa: papel das vias de sinalização p38 MAPK e NF-kB / Modulation of cell proliferation, survival and gene expression of inflammatory mediators by RAGE and TLR signaling in cells of the innate and adaptive immune response: role of p38 MAPK and NF-KB

O diabetes está associado à maior susceptibilidade à infecções e sepsis, demonstrando uma influência desta condição sobre a resposta imune. A doença periodontal é um tipo de infecção crônica, modulada pela resposta imune que apresenta maior prevalência e severidade em pacientes diabéticos. Nosso objetivo foi avaliar um possível sinergismo entre os receptores RAGE e TLR4 na modulação da proliferação celular, atividade metabólica, apoptose e expressão de citocinas inflamatórias em células da resposta imune inata e adaptativa. Como objetivo secundário, avaliamos o papel das vias de sinalização p38 MAPK e NF-kB na expressão dos genes inflamatórios por estas células após estimulação de RAGE e TLR4. Linhagens de células humanas de linfócitos T (JM) e monócitos (U937) foram estimulados com LPS e AGE-BSA tanto de forma independente como associados. A estimulação foi realizada também na presença e na ausência de inibidores bioquímicos para p38 MAPK (SB203580) e NF-kB (Bay 11-7082). A proliferação celular foi determinada por ensaio de exclusão azul de trypan, a apoptose pela via intrínseca e atividade metabólica foi avaliada por um ensaio bioquímico da função mitocondrial, a expressão de citocinas foi estudada por RT-PCR e RTqPCR e a ativação das vias de sinalização de interesse pelos estímulos utilizados foi investigada através de Western blotting. LPS e AGE-BSA não influenciaram a proliferação e sobrevivência celular de monócitos e linfócitos T após 24, 48 e 72 h. LPS, isoladamente ou associado a AGE, induziu a expressão de IL-6 e TNF-α em monócitos e células T, respectivamente. A ativação de p38 MAPK, mas não de NF-kB, foi necessária para a indução por LPS e LPS/AGE de IL-6 e TNF-α por LPS, isolado ou associado a AGE. A expressão de RNAm de RAGE foi detectada em ambos os tipos de célulares. RNAm de CCL3 foi expresso de forma mais marcante em monócitos, particularmente após estimulação com LPS. Não houve sinergismo na sinalização entre RAGE e TLR4 na modulação da expressão de IL-6, TNF-α, RAGE, CCR5 e CCL3 por monócitos e células T

Diabetes is associated to increased susceptibility to infections and sepsis, indicating that this condition modulates the immune response. Periodontal disease is one type of chronic infection, which is modulated by the immune response and presents with increased prevalence and severity in diabetic patients. Our objective was to evaluate a possible synergism between RAGE and TLR4 signaling on the modulation of cell proliferation, metabolic activity, apoptosis and gene expression of inflammatory cytokines by cells of the innate and adaptive immune response. As a secondary objective, we assessed the role of p38 MAPK and NF-kB signaling pathways on the expression of the inflammatory genes by these cells after stimulation of RAGE and TLR4. Human cell lines of T lymphocytes (JM) and monocytes (U937) were stimulated with LPS and AGE-BSA both independently and associated. Stimulation was also performed in the presence and absence of biochemical inhibitors for p38 MAPK (SB203580) and NF-kB (Bay 11-7082). Cell proliferation was determined by trypan blue dye exclusion assay, apoptosis by the intrinsic pathway and metabolic activity were assessed by a biochemical assay of the mitochondrial function, cytokine gene expression was studied by RTPCR and RT-qPCR and the activation of the selected signaling pathways after RAGE and TLR4 activation was investigated by Western blotting. LPS and AGE-BSA did not influence cell proliferation and survival 24, 48 and 72 h after stimulation. LPS, alone or associated with AGE-BSA, induced expression of IL-6 and TNF- mRNA by monocytes and T cells, respectively. Activation of p38 MAPK, but not of NF-kB, was required for LPS and LPS/AGE-induced induction of IL-6 and TNF. RAGE mRNA expression was detected in both cell types. CCL3 mRNA expression levels were higher in monocytes upon stimulation with LPS. There was no synergism between RAGE and TLR4 signaling on the expression of IL-6, TNF-, RAGE, CCR5 and CCL3 by monocytes and T cells

Úlceras nos membros inferiores de pacientes diabéticos: mecanismos moleculares e celulares / Lower limb ulcers in diabetic patients: molecular and cellular mechanisms

Diabetes mellitus representa um grupo de desordens metabólicas heterogêneas que surge como resultado de hiperglicemia por déficit na secreção e/ou ação da insulina. Sua prevalência e gastos relacionados vêm crescendo no mundo todo. Entre suas complicações de longo prazo, a que mais gera admissões hospitalares é a úlcera de membros inferiores. Estas feridas frequentemente tornam-se crônicas devido a uma série de aberrações moleculares e celulares do processo de cicatrização, sendo as principais: alta concentração de metaloproteinases(MMPs), neuropatia, alta probabilidade de infecção e resposta inflamatória não fisiológica, estresse oxidativo, formação excessiva de AGEs (produtos de glicoxidação avançada), neoangiogênese deficiente, desbalanço entre metabolismo e entrega de nutrientes, concentrações inadequadas de fatores de crescimento e reguladores de expressão gênica, e anormalidades celulares. Com melhor compreensão científica desses eventos e da cicatrização fisiológica, novas abordagens da patologia poderão fornecer resultados mais satisfatórios ao seu tratamento.

Diabetes depictures a heterogeneous group of metabolic disorders that arise as a result of hyperglycemia due to the deficit of secretion and/or insulin action. Its prevalence and related costs have been growing around the world. Among its long-term complications, foot ulcer is the one that generates morehospital admissions. These wounds often become chronic due to a series of molecular and cellular aberrations of the healing process, being the main mechanisms the following: high concentrations of matrix metalloproteinases (MMPs), neuropathy, high probability ofinfection and non-physiological inflammatory response, oxidativestress, excessive formation of AGEs (advanced glicoxidation end-products), deficient neoangiogenesis, imbalance between metabolism and nutrient delivery, inadequate concentrationsof growth factors and gene expression regulators, and cellular abnormalities. With better scientific understanding of these events and physiological healing, new approaches to disease can providemore satisfactory results to the treatment.

Produtos da glicação avançada dietéticos e as complicações crônicas do diabetes / Dietetics advanced glycation end-products and chronic complications of diabetes

A geração dos produtos de glicação avançada é um dos principais mecanismos desencadeadores das doenças associadas ao diabetes mellitus, que incluem cardiopatia, retinopatia, neuropatia e nefropatia. Esta revisão tem como objetivo analisar o papel dos produtos de glicação avançada presentes na alimentação como mediadores das complicações diabéticas e apresentar estratégias de redução de sua ingestão. Para tanto, foram realizados levantamentos em bancos de dados de publicações da área, dos últimos 15 anos, considerando-se artigos de revisão, estudos clínicos e experimentais. Os produtos de glicação avançada são um grupo heterogêneo de moléculas formadas a partir de reações não enzimáticas entre grupamentos amino e carbonilo, sendo a carboximetilisina e a pentosidina exemplos de produtos de glicação avançada identificados em alimentos e in vivo. Os produtos de glicação avançada ingeridos são absorvidos, somando-se aos endógenos no surgimento e na progressão das diversas complicações do diabetes, existindo uma correlação direta entre o consumo e a concentração sanguínea. Sua restrição na alimentação se correlaciona à supressão dos níveis séricos de marcadores de doença vascular e de mediadores inflamatórios diretamente envolvidos no desenvolvimento das degenerações diabéticas. As atuais orientações dietéticas centram-se na proporção em nutrientes e na restrição energética, sem considerar o risco da ingestão de produtos de glicação avançada formados durante o processamento dos alimentos. Recomendações simples, como a utilização de temperaturas baixas por períodos mais curtos, em presença de água, no preparo de alimentos, exercem efeitos importantes na prevenção das complicações do diabetes. O estudo dos mecanismos envolvidos na geração de produtos de glicação avançada e das propriedades anti-glicação de compostos presentes nos alimentos podem contribuir com a conduta terapêutica, concorrendo para a melhoria da qualidade de vida dos portadores...

The generation of advanced glycation end products is one of the principal mechanisms that lead to the pathologies associated with diabetes mellitus, which include cardiopathy, retinopathy, neuropathy and nephropathy. The objective of this revision is to analyse the role of the advanced glycation end products present in food as intermediaries of diabetic complications, presenting strategies to reduce their ingestion. For this purpose, research was carried out in databases of publications of the area, for the last 15 years, taking into account revision, experimental and clinical studies. Advanced glycation end products are a heterogenous group of molecules coming from non-enzymatic reactions between amino and carbonyl groups, examples being carboxymethyllisine and pentosidine found in food and in vivo. The advanced glycation end products ingested are absorbed and, along with endogenous advanced glycation end-products, promote the progression of the complications of diabetes. There is a direct correlation between advanced glycation end products consumption and blood concentration. Their restriction in food results in the suppression of serum levels of the markers of vascular disease and the intermediaries of inflammation directly involved in the development of diabetic degenerations. The current dietary orientations are concentrated on the proportion of nutrients and on energetic restriction. The risk of ingestion of advanced glycation end products formed during the processing of food should be taken in consideration. It is simply recommended that in the preparation of food, the use of low temperatures for short periods, in the presence of water, has important effects in the prevention of the complications of diabetes. The study of the mechanisms involved in the generation of advanced glycation end products and the antiglycation properties of compounds presented in foods can contribute to a therapeutic practice and an improvement in the...

Produtos finais de glicosilação avançada (age) e a exacerbação da doença periodontal em diabéticos: revisão de literatura / Advanced glycation end products (AGE) and the exacerbation of periodontal disease in diabetics patients: review

Os estudos sobre a patogênese das complicações do diabete têm se direcionado a investigar o papel de compostos biologicamente ativos formados através de ligação da glicose com proteínas ou lipídios, conhecido como AGEs (produtos finais de glicosilação avançada) e a interação com receptores específicos na superfície de membrana celulares (RAGE). Esses compostos e seus receptores estão drasticamente aumentados em indivíduos diabéticos e possuem um papel biopatológico extremamente importante no desenvolvimento e na exacerbação das complicações diabéticas. Sendo o diabete uma condição sistêmica considerada um fator de risco na prevalência e severidade da doença periodontal, faz-se necessário entender os mecanismos dessa interação entre essas doenças e as possíveis alternativas de tratamento. O objetivo desse trabalho é esclarecer o mecanismo de formação de AGEs, bem como suas implicações no processo inflamatório, inclusive na patogeniada doença periodontal e enfatizar as pesquisas que visam interferir na formação ou interação dessas moléculas, a fim de minimizarmos os efeitos da condição sistêmica dos diabéticos.

The complications of diabetes mellitus have been extensively investigated by studies on the pathology of this disease, with the purpose to understand the role of AGEs (advanced glycation end products), active biological components formed through association of glucose with proteins or lipids, as well as their interaction with specific receptor localized in the cellular membrane (RAGE). It has been shown that the AGE-RAGE system increased remarkably in diabetic conditions and has an important participation in the development or exacerbation of diabetic complications. Since the diabetic status is a risk factor in the prevalence and severity of periodontal disease, efforts are necessary to understand the cellular mechanisms involved with AGEs andRAGE in the periodontal disease and possible alternatives of dental treatment. Thus, the aim of this review addresses concerns about how the AGE-RAGE system is produced as well as its implications in the inflammatory process, including the pathogenesis of periodontal disease. We emphasize theongoing research concerning the formation or interaction of the AGE-RAGE system in order to improve quality of life among patients in the diabetic status...