Vesículas de membrana externa (OMVs) extraídas de Escherichia coli e de Klebesiella pneumoniae

Gram-negative bacteria are major pathogens that develop antibiotic resistance and cause distinct types of infections. According to the WHO (World Health Organization), bacterial resistance is considered a public health problem. Multiresistance Klebsiella pneumoniae and E. coli are prevalent in many hospitals. These bacteria produce outer membrane vesicles (OMVs) these vesicles can contribute to bacterial survival by eliminating toxic compounds, removing misfolded periplasmic proteins, establishing a colonization niche, biofilm formation, drug delivery, and modulation of host defense and response. This work aimed to evaluate the production and extraction of OMVs produced by E. coli and K. pneumoniae, comparing two different gel filtration and ultracentrifugation methods. Furthermore, we evaluated the interference of OMVs on the growth of enteropathogenic E. coli, uropathogenic E. coli, and hematophatogenic K. pneumoniae strains verifying the viability test. The gel filtration extraction system obtained an elevated concentration when compared to ultracentrifugation method. We observed the presence of OmpA by eletrophoresis and Dot blotting, responsible for the structure of OMVs. The results showed interferences of OMV EC086-UC, EC086-GF and OMV-KP70 on E2348/69 growth were directly proportional to the concentration of OMVs but inversely proportional to the concentration of OMVs with OMV-KP70 on EC086 and KP70 growth. We concluded that vesicle interference on EC086, E2348/69, and KP70 growth should not be based only on optical density parameters but complemented with the viability test of each bacterium strain. The use of biotechnology tools like genetic modifications, OMVs can perform multiple functions carrying molecules with many capabilities to be applied in many fields such as immunology, diagnostics, clinical medicine.

As bactérias Gram-negativas são patógenos que apresentam resistência a diversos antibióticos. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), a resistência antimicrobiana é um problema de saúde pública. A Escherichia coli e a Klebsiella pneumoniae são multirresistentes e prevalentes nos ambientes hospitalares. Estas bactérias produzem vesículas de membrana externa (OMVs) e possuem diversas funções como: contribuição para a sobrevivência das bactérias através da neutralização de componentes tóxicos, eliminação de proteínas desnaturadas, estabelecimento do nicho de colonização, formação de biofilme, entrega de drogas, modulação do sistema de defesa e resposta imune. Este trabalho avaliou a produção e extração de OMVs produzidas por cepas de E. coli e K. pneumoniae comparando os métodos de extração das mesmas por da gel filtração e ultracentrifugação. Além disso, através do teste de viabilidade bacteriana avaliamos a interferência das OMVs no crescimento de E. coli enteropatogência, E. coli uropatogênica e K. pneumoniae hematopatogênica. A purificação das OMVs por gel filtração apresentou uma concentração elevada quando comparada com o método de ultracentrifugação. Identificamos, para ambos os métodos, através da eletroforese e imunoensaio a presença da proteína de membrana externa a OmpA, responsável pela estrutura das OMVs. Demonstramos pelos resultados que as EC086-UC, EC086-GF e OMV-KP70 interferiram no crescimento da cepa E2348/69 com padrão diretamente proporcional quando comparado com a concentração das vesículas. O contrário ocorreu na interferência da OMV KP70-UC, atuando sobre o crescimento de EC086 e KP70 de forma inversamente proporcional quando comparado com a concentração das vesículas. Concluímos que a interferência das vesículas sobre o crescimento deve levar em conta os parâmetros de densidade óptica e a viabilidade bacteriana. Assim, com as diversas ferramentas da biotecnologia como a engenharia genética podemos desenvolver OMVs capazes de carrear diversas moléculas e ser aplicada em vários campos da imunologia, diagnósticos e na medicina clínica.

Campylobacter fetus releases S-layered and immunoreactive outer membrane vesicles.

The study of outer membrane vesicles (OMVs) became relevant because of their probable important role in the transfer of virulence factors to host cells. Campylobacter fetus is mainly a mammal pathogen whose virulence characterization is still limited. The aim of this study was to evaluate and to characterize the secretion of OMVs in this bacterium. By transmission electron microscopy, we confirmed the production of OMVs in all the strains assayed. Purified OMVs showed a spherical shape and variable size, although comparable to those of other gram-negative bacteria. We also confirmed the presence of the S-layer on the surface of the OMVs of all the strains assayed with the exception of those derived from the NTCC reference strain. In addition, we demonstrated their immunoreactivity by the dot-blot assay. Hence, C. fetus OMVs could contribute to the modulation of the host response and constitute a candidate to be evaluated as an adjuvant of current vaccines used in the veterinary field. This work represents a platform to drive future studies towards the role of these subcellular structures in C. fetus-host interaction.

Produção e extração de vesículas de membrana externa (OMV) de Escherichia coli para o tratamento de infecções nosocomiais

Nosocomial infection it is an infection acquired by patient during the hospital stay. According to the WHO bacterial infections are a major cause of hospitalization and worldwide death. The excessive e improper use of antibiotics are elevating nosocomial infections and causes the emergence of resistant strains to these antimicrobials causing a economic impact in the country. Thus vaccines are the alternatives strategies for treating these infections. Escherichia coli is one of the leading emerging nosocomial pathogens and it’s a Gram-negative rod shaped bacterium that colonizes the gastrointestinal tract responsible for diseases such as sepsis, pneumonia, neonatal meningitis, peritonitis, and gastroenteritis. E. coli produces outer membrane vesicles (OMV) which are small spherical and highly immunogenic structures of 20-200 nm and may be an alternative vaccine against nosocomial infections. The vesicles are released during cell growth and production can be influenced by factors such as acidity, temperature, nutrient deficiency, etc. The objective of this work was to evaluate the production of OMV by E. coli strain 17/38 (provided by HU – Hospital Universitário) in shaker, using different cultivation conditions (pH, temperature and time) and extraction by tangential filtration or ultracentrifugation. For quantification and characterization of OMV, we performed protein dosage tests, electrophoresis and electron microscopy. Based on the results, we conclude that: pH, temperature and time affected the production of OMV; the OMV extraction by tangential filtration proved to be a promising technology when compared with ultracentrifugation. Despite the great knowledge regarding OMVs as mediators of virulence and to bacterial survival there are still many aspects to be elucidated regarding the impact of these OMVs on microorganisms and the human host.

As infecções hospitalares (nosocomiais) são adquiridas por pacientes em ambiente hospitalar. Segundo a OMS, as infecções bacterianas ainda são uma das principais causas de hospitalização e morte em todo o mundo. O uso excessivo inadequado de antibióticos aumenta as infecções nosocomiais em virtude do surgimento de cepas resistentes a estes antimicrobianos causando grande impacto econômico no país. Assim, as vacinas são as estratégias para tratamento destas infecções. Escherichia coli é um dos principais patógenos nosocomiais emergentes e é uma bactéria Gram-negativa em forma de bastonete que coloniza o trato gastrointestinal, responsável por várias doenças, como septicemia, pneumonia, meningite neonatal, peritonite e gastroenterite. A E. coli produz vesículas da membrana externa (OMV) que são pequenas estruturas esféricas e altamente imunogênicas de 20 a 200 nm e pode ser uma vacina alternativa contra infecções nosocomiais. As vesículas são liberadas durante o crescimento celular e a produção pode ser influenciada por fatores como acidez, temperatura, deficiência de nutrientes, etc. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de OMV por E. coli cepa 17/38 (fornecida pelo HU - Hospital Universitário) em "shaker", utilizando diferentes condições do cultivo (pH, temperatura e tempo) e extração por filtração tangencial ou ultracentrifugação. Para a quantificação e caracterização de OMVs realizamos testes de dosagem de proteína, eletroforese e microscopia eletrônica. Com base nos resultados, concluímos que: o pH, temperatura e tempo afetaram a produção de OMV; extração de OMV pela filtração tangencial mostrou-se uma tecnologia promissora quando comparada com a ultracentrifugação. Assim, apesar do grande conhecimento a respeito de OMVs como mediadores de virulência e da necessidade para a sobrevivência bacteriana, ainda existem muitos aspectos a serem elucidados a respeito do impacto destas OMVs nos microrganismos e no hospedeiro humano.

Estandarización de un ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra vesículas de membrana externa de Salmonella Paratyphi A / Standardization of an ELISA for the quantification of IgG antibodies against outer membrane vesicle of Salmonella Paratyphi A

Salmonella Paratyphi A es un patógeno exclusivo de humanos, siendo la segunda causa más común de fiebre entérica en el sudeste asiático. Recientemente la incidencia en este continente ha aumentado, desplazando a Salmonella entérica serotipo Typhi como la primera causa de fiebre entérica. En la actualidad no existen vacunas licenciadas contra S. Paratyphi A. El Instituto Finlay de Vacunas se encuentra trabajando en la obtención de un candidato vacunal basado en vesículas de membrana externa (VME) contra S. Paratyphi A, por lo que se hizo necesario contar con una técnica para la evaluación de su inmunogenicidad. El objetivo de este trabajo fue la estandarización de un ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra VME de S. Paratyphi A. Para ello, se determinaron las mejores condiciones de este ensayo en cuanto a concentración óptima de recubrimiento y dilución de trabajo del conjugado. Además, se definió el intervalo y linealidad de la curva, la precisión intra e interensayo, la especificidad y el límite de detección. La curva de calibración se generó con un suero estándar interno y presentó un buen ajuste lineal con un R² =0.98. Los coeficientes de variación en los ensayos de precisión intra e interensayo estuvieron en los intervalos establecidos para cada uno (=10 por ciento, =20 por ciento respectivamente). Los resultados obtenidos avalan el empleo de este ELISA cuantitativo para la evaluación de la inmunogenicidad de formulaciones de VME de S. Paratyphi A en fases de investigación y desarrollo(AU)

Salmonella Paratyphi A, is an exclusive pathogen of humans, being the second most common cause of enteric fever in Southeast Asia. Recently the incidence of this disease in this continent has increased, displacing Salmonella enterica serotype Typhi as the first cause of enteric fever. Currently there are no vaccines licensed against S. Paratyphi A. The Finlay Institute of Vaccines is working on obtaining a vaccine candidate based on outer membrane vesicles (VME) against S. Paratyphi A, so it became necessary to develop a technique for the evaluation of its immunogenicity. The objective of this work was the standardization of an ELISA for the quantification of IgG antibodies against VME of S. Paratyphi A. The best conditions of this assay were determined in terms of optimum concentration of coating and working dilution of the conjugate. In addition, the interval and linearity of the curve, the intra- and inter-assay precision, the specificity and the limit of detection were defined. The calibration curve was generated with an internal standard serum and presented a good linear fit with an R² =0.98. The coefficients of variation in the intra- and interassay precision tests were in the intervals established for each one (=10 percent, =20 percent respectively). The results obtained support the use of this quantitative ELISA for the evaluation of the immunogenicity of VME formulations of S. Paratyphi A in research and development phases(AU)

Estandarización de un ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra vesículas de membrana externa de Salmonella Paratyphi A / Standardization of an ELISA for the quantification of IgG antibodies against outer membrane vesicle of Salmonella Paratyphi A

Salmonella Paratyphi A es un patógeno exclusivo de humanos, siendo la segunda causa más común de fiebre entérica en el sudeste asiático. Recientemente la incidencia en este continente ha aumentado, desplazando a Salmonella entérica serotipo Typhi como la primera causa de fiebre entérica. En la actualidad no existen vacunas licenciadas contra S. Paratyphi A. El Instituto Finlay de Vacunas se encuentra trabajando en la obtención de un candidato vacunal basado en vesículas de membrana externa (VME) contra S. Paratyphi A, por lo que se hizo necesario contar con una técnica para la evaluación de su inmunogenicidad. El objetivo de este trabajo fue la estandarización de un ELISA para la cuantificación de anticuerpos IgG contra VME de S. Paratyphi A. Para ello, se determinaron las mejores condiciones de este ensayo en cuanto a concentración óptima de recubrimiento y dilución de trabajo del conjugado. Además, se definió el intervalo y linealidad de la curva, la precisión intra e interensayo, la especificidad y el límite de detección. La curva de calibración se generó con un suero estándar interno y presentó un buen ajuste lineal con un R2 =0.98. Los coeficientes de variación en los ensayos de precisión intra e interensayo estuvieron en los intervalos establecidos para cada uno (=10 por ciento, =20 por ciento respectivamente). Los resultados obtenidos avalan el empleo de este ELISA cuantitativo para la evaluación de la inmunogenicidad de formulaciones de VME de S. Paratyphi A en fases de investigación y desarrollo(AU)

Salmonella Paratyphi A, is an exclusive pathogen of humans, being the second most common cause of enteric fever in Southeast Asia. Recently the incidence of this disease in this continent has increased, displacing Salmonella enterica serotype Typhi as the first cause of enteric fever. Currently there are no vaccines licensed against S. Paratyphi A. The Finlay Institute of Vaccines is working on obtaining a vaccine candidate based on outer membrane vesicles (VME) against S. Paratyphi A, so it became necessary to develop a technique for the evaluation of its immunogenicity. The objective of this work was the standardization of an ELISA for the quantification of IgG antibodies against VME of S. Paratyphi A. The best conditions of this assay were determined in terms of optimum concentration of coating and working dilution of the conjugate. In addition, the interval and linearity of the curve, the intra- and inter-assay precision, the specificity and the limit of detection were defined. The calibration curve was generated with an internal standard serum and presented a good linear fit with an R2 =0.98. The coefficients of variation in the intra- and interassay precision tests were in the intervals established for each one (=10 percent, =20 percent respectively). The results obtained support the use of this quantitative ELISA for the evaluation of the immunogenicity of VME formulations of S. Paratyphi A in research and development phases(AU)

Caracterização do secretoma de cepas de Xylella fastidiosa / Characterization of the secretome Xylella fastidiosa strains

As doenças causadas pelo fitopatógeno Xylella fastidiosa, uma bactéria Gram-negativa, devem-se aos seus múltiplos fatores de virulência, tais como formação de biofilme, secreção de enzimas de degradação da parede celular do xilema (CWDE), expressão de proteínas de adesão e produção de vesículas de membrana externa (OMVs). Esses fatores de virulência são controlados por uma via de sinalização mediada por DSF (fatores de sinalização difusíveis de natureza lipídica) e relacionada com percepção de quórum. Nesse trabalho, tivemos como objetivo ampliar a caracterização do secretoma de cepas selvagens e mutantes de X. fastidiosa para evidenciar proteínas e metabólitos potencialmente associados à adaptação ao hospedeiro, virulência e patogenicidade. Desenvolvemos, paralelamente, três estudos empregando como abordagens metodológicas a proteômica, a metabolômica e a transcritômica. No primeiro estudo, comparamos o secretoma (exoproteoma) da cepa Temecula1 selvagem (WT) e do mutante no gene da sintase de DSF (ΔrpfF), o qual exibe fenótipo de hipervirulência em videiras. A este estudo associamos a comparação dos transcritomas dessas cepas. Os resultados mostraram que, mesmo no cultivo in vitro, X. fastidiosa expressa e secreta fatores de virulência previamente conhecidos (lipases-esterases e proteases), além de toxinas (microcinas) que, supostamente, teriam papel de controlar bactérias competidoras pelo mesmo nicho. No segundo estudo caracterizamos a composição de OMVs secretadas no cultivo in vitro por X. fastidiosa Fb7 e 9a5c (cepas isoladas de laranjeiras) e Temecula1 (cepa isolada de videira). Demonstramos que Fb7 produz até 57% mais OMVs que 9a5c e Temecula1 e identificamos um total de 202 proteínas distintas nas OMVs produzidas pelas 3 cepas, ampliando consideravelmente o número de proteínas secretadas por meio de OMVs descrito, até então, para X. fastidiosa. Entre as proteínas enriquecidas, citamos adesinas afimbriais, porinas, lipoproteínas, hidrolases (lipases/esterases, proteases e peptidases) e uma pectina-liase putativa. Destacamos a detecção da enzima L-ascorbato oxidase nas OMVs e sugerimos que esta enzima poderia atuar na depleção do ascorbato produzido pelo hospedeiro vegetal. Além disso, demonstramos, pela primeira vez, que OMVs de X. fastidiosa transportam ácidos graxos da família DSF, sugerindo um papel adicional para OMVs nesse fitopatógeno. Finalmente, no terceiro estudo verificamos alterações relevantes no perfil de metabólitos secretados por X. fastidiosa em resposta a sua interação com metabólitos secretados por Burkholderia phytofirmans, proposta como uma cepa para o biocontrole da doença de Pierce de videiras. Confirmamos que o sobrenadante de B. phytofirmans possui um composto de natureza apolar que induz a formação de biofilme em X. fastidiosa, contudo ainda não foi possível decifrar a natureza química deste composto

The diseases caused by the phytopathogen Xylella fastidiosa, a Gram-negative bacterium, are due to multiple virulence factors, such as biofilm formation, secretion of xylem cell wall degradation enzymes (CWDE), expression of adhesion proteins and production of outer membrane vesicles (OMVs). These virulence factors are controlled by a DSF (diffusible signaling factors of a lipidic nature) mediating signaling pathway and related to quorum sensing perception. In this work, we aimed to extend the characterization of the secretoma of wild type and mutants strains of X. fastidiosa to uncover proteins and metabolites potentially associated to host adaptation, virulence and pathogenicity. We developed three studies in parallel using proteomics, metabolomics and transcriptomics as methodological approaches. In the first study, we compared the secretome (exoproteome) of the wild type strain Temecula1 (WT) and of DSF synthase mutant (ΔrpfF) which exhibits hypervirulence phenotype in grapevines. We also compared the transcriptomes of these strains. Our results showed that, even in in vitro culture, X. fastidiosa expresses and secretes previously known virulence factors (lipasesesterases and proteases), as well as toxins (microcins) that might play a role in controlling competing bacteria in the same niche. In the second study, we characterized the composition of OMVs secreted by in vitro cultures of X. fastidiosa Fb7 and 9a5c (strains isolated from orange trees) and Temecula1 (strain isolated from grapevine). We have shown that Fb7 produces up to 57% more OMVs than the 9a5c and Temecula1. Moreover we identified a total of 202 distinct proteins in the OMVs produced by these three strains, increasing considerably the number of OMVs secreted proteins so far described for X. fastidiosa. Among the proteins enriched in OMVs, we point out afimbrial adhesins, porins, lipoproteins, hydrolases (lipases/esterases, proteases and peptidases) and a putative pectin-lyase. We highlight the detection of the enzyme L-ascorbate oxidase in the OMVs and we suggest that this enzyme could act in the depletion of ascorbate produced by the plant host. In addition, we have demonstrated, for the first time, that X. fastidiosa OMVs transport fatty acids from the DSF family, suggesting an additional role for OMVs in this phytopathogen. Finally, in the third study we verified relevant changes in the profile of metabolites secreted by X. fastidiosa in response to the interaction with metabolites secreted by Burkholderia phytofirmans that has been sugested as a biocontrol strain for Pierce's disease in grapevines. We confirm that the B. phytofirmans supernatant has a non-polar compound that induces biofilm formation in X. fastidiosa, but it has not yet been possible to elucidate the chemical nature of this compound