Estudio proteómico 2DE-DIGE en plasma sanguíneo de pacientes en etapa infantil con leucemia linfoblástica aguda / 2DE-DIGE proteomic study in blood plasma of patients in childhood stage with acute lymphoblastic leukemia / Estudo proteômico 2DE-DIGE no plasma sanguíneo de pacientes em estágio infantil com leucemia linfoblástica aguda

Resumen En Colombia, durante la última década, la leucemia linfoblástica aguda (LLA) ha causado más del 40% de las muertes por cáncer en menores de edad. Entre los factores que influyen en estas cifras, el diagnóstico tardío es uno de los factores que más afecta el éxito del tratamiento. Por lo anterior, esta investigación se centró en el estudio del proteoma plasmático de niños colombianos diagnosticados con LLA tipo B, en comparación con controles en la búsqueda de proteínas que podrían ser clasificadas como biomarcadores de diagnóstico. En vista de los avances en las herramientas proteómicas y de espectrometría de masas y teniendo en cuenta que son una alternativa para abordar la complejidad molecular de enfermedades como el cáncer, se utilizó una aproximación proteómica basada en una separación por electroforesis bidimensional diferencial (2DE-DIGE) con posterior separación por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) en tándem. Se encontraron ocho proteínas con expresión diferencial en plasma de pacientes con LLA-B, entre las cuales resaltan la Serotransferrina, la Alfa-1-antitripsina, la Haptoglobina, la Alfa-2-glicoproteína de zinc y el Complemento C3.

Abstract In Colombia, during the last decade, acute lymphoblastic leukemia (ALL) has caused more than 40% of cancer deaths in children. Among the factors that influence these figures, late diagnosis is one of the factors that affects the treatment success. Therefore, this research focused on the plasma proteome study of Colombian children diagnosed with B-cell ALL, as compared with healthy controls in the search of proteins that could be classified as diagnostic biomarkers. Now, in view of the advances in the proteomics and mass spectrometry tools and taking into account that they are an alternative to address the molecular complexity of diseases such as cancer, a proteomic approach, based on bidimensional difference gel electrophoretic separation (2DE-DIGE) coupled to LC-MS/ MS, was used. We found eight differentially expressed proteins in plasma from B-cell ALL patients as follows: Serotransferrin, Alpha-1-antitrypsin, Haptoglobin, Zinc-alpha-2-glycoprotein, and Complement C3.

Resumo Na Colômbia, durante a última década, a leucemia linfoblastica aguda (LLA) tem sido o câncer com maior incidência, com mais de 40% das mortes por câncer em menores atribuídas a essa doença. Entre os fatores que influenciam esses números, o diagnóstico tardio talvez seja o fator mais sensível que afeta negativamente o sucesso do tratamento. Esta pesquisa enfocou o estudo do proteoma plasmático de crianças colombianas diagnosticadas com LLA tipo B, dada a sua alta incidência, em comparação com controles na busca por proteínas que poderiam ter potencialidade para serem classificadas como biomarcadores diagnósticos. Agora, em vista dos avanços nas ferramentas de proteômica e espectrometria de massa e sabendo que eles são uma alternativa para abordar a complexidade molecular de doenças como o câncer, usamos uma abordagem proteômica baseada em uma separação por eletroforese bidimensional diferencial (2DE-DIGE) com subsequente separação por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa em tandem. Encontramos 8 proteínas com expressão diferencial no plasma de pacientes com LBA, dentre os quais a Serotransferrina, a Alfa-1-antitripsina, a Haptoglobina, a Glicoproteína alfa-2-zinco e o Complemento C3.

Physical evaluation, morphological and identification of seminal proteins in Santa Ines sheep / Avaliação física, morfológica e identificação de proteínas seminais em ovinos da raça Santa Inês

This study aimed to identify proteins in the seminal plasma associated with fertility in sheep of Santa Inês in Manaus, AM, using twodimensional electrophoresis techniques associated with mass spectrometry. Semen samples from eight adult sheep were collected by removing an aliquot for the physical and morphological assessments of semen and seminal plasma was subjected to SDS-PAGE profile and two-dimensional electrophoresis. Gels were stained with colloidal Coomassie, scanned and analyzed using ImageMaster 2D Platinum software, version 6.0. The selected individual spots were cut from the master gel, digested with trypsin and subjected to identification by mass spectrometry (MALDITof / Tof). Of the 108 spots detected in the gel, it selected 10 differential spots (based on the distribution thereof in the bidimensional gel and pre-analysis of the 2D ImageMaster Platinum Software) identifying 03 proteins: clusterin, a protein 14-3-3 zeta chain and Ram Seminal versicles 22kDa Protein. The identity of these proteins implies that the components of seminal plasma participate in physiological processes involved in sperm protection, motility and sperm capacitation, all associated with fertility. These proteins need to be better studied to see whether the same could be used as molecular markers of fertility as they were also found in other studies conducted with sheep Santa Ines.

Este estudo teve como objetivo identificar proteínas do plasma seminal associadas à fertilidade em ovinos da raça Santa Inês em Manaus, AM, utilizando técnicas de eletroforese bidimensional associadas à espectrometria de massa. Amostras de sêmen de oito carneiros adultos foram coletadas, retirando-se uma alíquota para as avaliações físicas e morfológicas do sêmen, e o plasma seminal foi submetido ao perfil SDS-PAGE e à eletroforese bidimensional. Os géis foram corados com Coomassie coloidal, digitalizados e analisados no aplicativo ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0. Os spots selecionados foram cortados individualmente do gel mestre, digeridos com tripsina e submetidos à identificação por espectrometria de massa (MALDI-Tof/Tof). Dos 108 spots detectados no gel, selecionou-se 10 spots diferenciais (com base na distribuição dos mesmos no gel bidimensional e com a pré-análise destes no ImageMaster 2D Platinum Software), identificando-se 03 proteínas: a clusterina, a 14-3-3 protein zeta chain e a Ram Seminal Versicles 22kDa Protein. A identidade dessas proteínas infere que os componentes do plasma seminal participam de processos fisiológicos ligados à proteção do espermatozoide, sua motilidade e capacitação espermática, todos associados à fertilidade. Essas proteínas precisam ser melhor estudadas para verificar se as mesmas poderiam ser utilizadas como marcadores moleculares de fertilidade, já que também foram encontradas em outros trabalhos realizados com ovinos da raça Santa Inês.

Physical evaluation, morphological and identification of seminal proteins in Santa Ines sheep / Avaliação física, morfológica e identificação de proteínas seminais em ovinos da raça Santa Inês

This study aimed to identify proteins in the seminal plasma associated with fertility in sheep of Santa Inês in Manaus, AM, using twodimensional electrophoresis techniques associated with mass spectrometry. Semen samples from eight adult sheep were collected by removing an aliquot for the physical and morphological assessments of semen and seminal plasma was subjected to SDS-PAGE profile and two-dimensional electrophoresis. Gels were stained with colloidal Coomassie, scanned and analyzed using ImageMaster 2D Platinum software, version 6.0. The selected individual spots were cut from the master gel, digested with trypsin and subjected to identification by mass spectrometry (MALDITof / Tof). Of the 108 spots detected in the gel, it selected 10 differential spots (based on the distribution thereof in the bidimensional gel and pre-analysis of the 2D ImageMaster Platinum Software) identifying 03 proteins: clusterin, a protein 14-3-3 zeta chain and Ram Seminal versicles 22kDa Protein. The identity of these proteins implies that the components of seminal plasma participate in physiological processes involved in sperm protection, motility and sperm capacitation, all associated with fertility. These proteins need to be better studied to see whether the same could be used as molecular markers of fertility as they were also found in other studies conducted with sheep Santa Ines.(AU)

Este estudo teve como objetivo identificar proteínas do plasma seminal associadas à fertilidade em ovinos da raça Santa Inês em Manaus, AM, utilizando técnicas de eletroforese bidimensional associadas à espectrometria de massa. Amostras de sêmen de oito carneiros adultos foram coletadas, retirando-se uma alíquota para as avaliações físicas e morfológicas do sêmen, e o plasma seminal foi submetido ao perfil SDS-PAGE e à eletroforese bidimensional. Os géis foram corados com Coomassie coloidal, digitalizados e analisados no aplicativo ImageMaster 2D Platinum, versão 6.0. Os spots selecionados foram cortados individualmente do gel mestre, digeridos com tripsina e submetidos à identificação por espectrometria de massa (MALDI-Tof/Tof). Dos 108 spots detectados no gel, selecionou-se 10 spots diferenciais (com base na distribuição dos mesmos no gel bidimensional e com a pré-análise destes no ImageMaster 2D Platinum Software), identificando-se 03 proteínas: a clusterina, a 14-3-3 protein zeta chain e a Ram Seminal Versicles 22kDa Protein. A identidade dessas proteínas infere que os componentes do plasma seminal participam de processos fisiológicos ligados à proteção do espermatozoide, sua motilidade e capacitação espermática, todos associados à fertilidade. Essas proteínas precisam ser melhor estudadas para verificar se as mesmas poderiam ser utilizadas como marcadores moleculares de fertilidade, já que também foram encontradas em outros trabalhos realizados com ovinos da raça Santa Inês.(AU)

Proteomics analysis after traumatic brain injury in rats: the search for potential biomarkers / Análise proteômica após lesão cerebral traumática em ratos: a busca por biomarcadores

Many studies of protein expression after traumatic brain injury (TBI) have identified biomarkers for diagnosing or determining the prognosis of TBI. In this study, we searched for additional protein markers of TBI using a fluid perfusion impact device to model TBI in S-D rats. Two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry were used to identify differentially expressed proteins. After proteomic analysis, we detected 405 and 371 protein spots within a pH range of 3-10 from sham-treated and contused brain cortex, respectively. Eighty protein spots were differentially expressed in the two groups and 20 of these proteins were identified. This study validated the established biomarkers of TBI and identified potential biomarkers that could be examined in future work.

Muitos estudos de expressão proteica após lesão cerebral traumática (LCT) identificam biomarcadores para determinação diagnóstica ou prognóstica do LCT. No presente estudo, foram investigados marcadores proteicos adicionais de LCT, através de um aparelho de impacto no fluxo e perfusão em ratos S-D. Eletroforese bidimensional em gel e espectrometria de massa foram utilizadas para identificar diferentes proteínas expressas. Após a análise proteômica, detectamos marcas de proteínas 405 e 371, com pH variando entre 3-10 no córtex de ratos sham e naqueles com contusão cerebral, respectivamente. Oitenta marcas proteicas foram expressas nos dois grupos e 20 destas proteínas foram identificadas. Este estudo validou o estabelecimento de biomarcadores de LCT e identificou potencial biomarcadores que poderão ser estudados em estudos futuros.

Microproteínas urinarias en diabéticos tipo 2 normoalbuminúricos / Urinary microproteins in normoalbuminuric type 2 diabetic patients / Microproteínas urinárias em diabéticos tipo 2 normoalbuminúricos

En pacientes diabéticos tipo 2 normoalbuminúricos se observa la presencia de Microproteínas Urinarias (MU) en el rango 68-25 kDa. El objetivo del trabajo fue identificar en distintos estadios de la nefropatía diabética si dicho rango corresponde a un marcador de daño tubular. Se estudiaron 119 orinas espontáneas de pacientes diabéticos tipo 2; se les midió la relación albúmina/creatinina urinaria y la creatinina sérica. Se dividieron en 5 grupos: 71 normoalbuminúricos, 28 microalbuminúricos, 12 macroalbuminúricos, 2 urémicos en pre-diálisis y 6 en hemodiálisis. Las MU se detectaron en geles de poliacrilamida en 2 dimensiones para uso clínico y se analizaron con el programa Image J 1.30v. La identificación de las MU se realizó por “immunoblotting” o por espectrometría de masa MALDI-TOF-TOF. El 66% de los normoalbuminúricos presentaron las siguientes MU: orosomucoide, fragmento de 35 kDa de la cadena pesada H4 del inter alfa I inhibidor de tripsina y Beta Trace, las cuales no reflejaron daño tubular debido a que la concentración de las mismas no se incrementó en los pacientes en hemodiálisis, en comparación con los normoalbuminúricos. Dichas proteínas están vinculadas al endotelio vascular y podrían constituir un marcador urinario vascular-tubular renal de utilidad clínica en patologías sistémicas con riesgo cardiovascular y funcionalidad renal conservada.

Urinary excretion of microproteins (MU) was detected in normoalbuminuric type 2 diabetic patients, in the range of 68-25 kDa using SDS-PAGE with silver staining. The purpose of this study was to identify MU in diabetic patients in different grades of diabetic nephropathy, in order to clarify the diagnostic relevance as a marker of renal tubular damage. In the spontaneous urine of 119 type 2 diabetic patients, urinary albumin, urinary creatinine and serum were determined. Five groups were formed: 71 normoalbuminuric, 28 microalbuminuric, 12 macroalbuminuric, 2 in pre-dialysis and 6 in hemodialysis. The MU were separated by two-dimensional polyacrylamid gel electrophoresis for clinical use (2D UC) and were identified by immunoblotting or MALDI-TOF-TOF mass spectrometry and analyzed using Image J version 1.30v. Of the normoalbuminurics patients studied, 66% excreted the following MU: orosomucoid, 35 kDa fragment of inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 (ITIH4) and Beta Trace; but their concentrations did not reflect tubular damage because they exhibited a progressive downregulation. These proteins are involved in vascular endothelium, and they could be a marker of renal tubular-microvascular disease that would be useful in systemic diseases with cardiovascular risk and with preserved renal function.

Em pacientes diabéticos tipo 2 “normoalbuminúricos” se observa a presença de microproteínas urinárias (MU) em um intervalo compreendido entre 68 e 25 kDa. O objetivo do trabalho é identificar em distintos estágios da nefropatia diabética se tal intervalo corresponde a um marcador de dano tubular. Foram estudadas 119 amostras de urina espontânea de pacientes diabéticos tipo 2; foi medida a reação albumina/creatinina urinária e a creatinina sérica. Dividiram-se em 5 grupos: 71 normoalbuminúricos, 28 microalbuminúricos, 12 macroalbuminúricos, 2 urêmicos pré-dialise e 6 em hemodiálise. Foram detectadas as MU em géis de poliacrilamida em duas dimensões para o uso clínico e analisadas com o programa Image J versão 1.30v. A identificação das MU foi realizada por “immunoblotting” ou por espectrometria de massa MALDI-TOF-TOF. 66% de normoalbuminúricos apresentaram as seguintes MU: orosomucoide, Fragmento de 35 kDa da cadeia pesada H4 do interalfa inibidor da tripsina e Beta Trace, as quais não mostraram dano tubular devido a que a concentração das mesmas não está aumentada nos pacientes em hemodiálise, em comparação com os normoalbuminúricos. Estas proteínas estão envolvidas com o endotélio vascular e poderiam constituir um marcador urinário vascular-tubular renal de utilidade clínica em patologias sistêmicas com risco cardiovascular e funcionalidade renal conservada.

Variação nos genes dos receptores mineralocorticoide e glicocorticoide e suas implicações proteômicas na qualidade da carne de bovinos Nelore / Variation in the mineralocorticoid and glucocorticoid receptors genes and proteomics implications for meat quality in cattle of Nellore breed

O eixo hipotálamo-pituitária-adrenal é o principal sistema neuroendócrino envolvido na regulação e adaptação da resposta ao estresse e, o principal hormônio secretado é o cortisol. O cortisol exerce seus efeitos por meio dos receptores mineralocorticoide (MR) e glicocorticoide (GR). Variações nos genes desses receptores têm sido associadas à sensibilidade aos glicocorticoides e mudanças no perfil metabólico. O objetivo geral desse trabalho foi compreender a variabilidade existente em relação às respostas fisiológicas de bovinos por meio da identificação de polimorfismos genéticos em genes envolvidos na resposta ao estresse e, verificar as consequências dessa variação genética em características de qualidade da carne. Dessa forma, três abordagens foram propostas: (1) avaliar a incidência de carne DFD (dark, firm and dry) e seu impacto no perfil metabólico, endócrino e características de qualidade da carne bovina, uma vez que o estresse é um dos principais fatores que levam a essa condição desfavorável; (2) avaliar a contribuição de fatores genéticos, por meio da identificação de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), no gene do MR e GR, e suas associações com as características mensuradas; (3) avaliar os efeitos desses polimorfismos sobre o perfil proteico do músculo bovino. Foram utilizados 241 bovinos da raça Nelore. Os resultados evidenciaram implicações direta do pH 24 horas post-mortem nos atributos de cor e perdas por cozimento da carne. A incidência de carnes DFD (pH>=5,8) foi de 18,7%. Os polimorfismos identificados mostraram influenciar em algumas características mensuradas. Os SNPs NR3C2_1 e NR3C2_2 no gene do MR foram associados ao conteúdo de glicogênio muscular e nível plasmático do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) post-mortem, e o SNP NR3C1_1 no gene do GR foi associado aos níveis plasmático de cortisol post-mortem. As análises proteômicas demonstraram que a maioria das proteínas reguladas por esses SNPs estão envolvidas na contração muscular, metabolismo e defesa celular. Portanto, é possível inferir que o pH tem impacto nas características de qualidade da carne e que polimorfismos em MR e o GR levam a mudanças na atividade do eixo HPA, no perfil metabólico do organismo e no perfil proteico do músculo, sugerindo que esses genes estão envolvidos em uma complexidade de funções e podendo ser alvos de estudos em sistemas de produção que visam melhorar a produtividade.

The hypothalamic-pituitary-adrenal axis is the main neuroendocrine system involved in the regulation and adaptation in stress response and the primary hormone secreted is cortisol. Cortisol exerts its effects through the mineralocorticoid (MR) and glucocorticoid (GR) receptors. Variations in the genes of these receptors have been associated with sensitivity to glucocorticoids and changes in the metabolic profile. The general objective of this work was to understand the variability in relation to physiological responses of cattle through identification of genetic polymorphisms in genes involved in stress response and, checking the consequences of this genetic variation in meat quality traits. Thus, three approaches have been proposed: (1) evaluate the incidence of DFD meat (dark, firm and dry) and its impact on metabolics, endocrines profiles and meat quality traits, since stress is the major factor that lead to this unfavorable condition; (2) evaluate the contribution of genetic factors through identification single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the MR and GR gene and its association with the measured traits; (3) evaluate the effects of these polymorphisms on the protein profile of bovine muscle. A total of 241 Nellore cattle were used. The results evidenced direct implications of 24 hours pH post-mortem in color attributes and cooking losses. The incidence of DFD meat (pH >= 5.8) was 18.7%. The polymorphisms identified demonstrated to influence some on measured characteristics. The NR3C2_1 and NR3C2_2 SNPs in MR gene were associated with muscle glycogen content and post-mortem adrenocorticotropic hormone (ACTH) plasma levels and, the NR3C1_1 SNP in GR was associated with post-mortem cortisol plasma levels. The proteomic analysis demonstrated that most proteins regulated by these SNPs are involved in muscle contraction, metabolism and cellular defense. Therefore, it is possible to infer that pH has impact on meat quality traits and MR and GR polymorphisms lead to changes in the HPA axis activity, metabolic profile and protein muscle profile, suggesting that these genes are involved in a complexity of functions and may be targets for studies on production systems to improve productivity.

Electroforesis bidimensional en orina: una alternativa para el laboratorio clínico / Two dimensional electrophoresis in urine: an alternative for the clinical laboratory / Eletroforese bidimensional em urina: uma alternativa para o laboratório clínico

En este trabajo se presenta un método confiable para el análisis de rutina de proteínas urinarias. El método es la electroforesis bidimensional que combina la electroforesis en acetato de celulosa con la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio seguida de tinción argéntica. La electroforesis bidimensional abre el espectro de proteínas, siendo algunas de ellas identificadas por immunoblotting o espectrometría de masa MALDI. Dichas proteínas son de bajo peso molecular: Orosomucoide (40 kDa), apolipoproteína AI (28 kDa), zinc-alfa 2-glicoproteína (43 kDa), fragmento del perlecan C-terminal LG3 (23 kDa), prostaglandina D2 sintasa tipo-lipocalina (29 kDa) e inter-alfa inhibidor de tripsina cadena pesada H4 (35 kDa). Estas proteínas están incluidas en estudios de falla renal aguda, falla renal crónica, trasplante renal, enfermedad glomerular y enfermedad maligna del tracto urogenital. El método, no invasivo, se aproxima a la tecnología emergente de la proteómica que permite el análisis simultáneo de varias proteínas urinarias como una herramienta para el diagnóstico y monitoreo de una variedad de enfermedades humanas.(AU)

A method suitable for routine clinical analyses of urinary proteins is presented. This method is a two-dimensional electrophoresis procedure, combining cellulose acetate electrophoresis and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels electrophoresis followed by silver staining. The resulting two-dimensional electrophoresis opened the protein spectrum and some of the latter were identified, by immunoblotting or MALDI mass spectrometry. There are low molecular weight protein: Orosomucoid (40 kDa), apolipoprotein AI (28 kDa), Zinc-alpha2-glycoprotein (43 kDa), C-terminal perlecan fragment LG3 (23 kDa), lipocalin-type prostaglandin D2 synthase (29 kDa) and inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 (35 kDa). They include studies of acute and chronic kidney injury, renal transplantation, glomerular disease and malignancy of the urogenital tract. This method approaching the emerging proteomic technologies allows simultaneous examination of the patterns of multiple urinary proteins as a powerful non-invasive tool for diagnosis and monitoring of variety of human diseases.(AU)

Neste trabalho é apresentado um método confiável para a análise de rotina de proteínas urinárias. O método é a eletroforese bidimensional que combina a eletroforese em acetato de celulose com a eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio seguida de tinþÒo argÛntea. A eletroforese bidimensional abre o espectro de proteínas, sendo algumas delas identificadas por immunoblotting ou espectrometria de massa MALDI. Tais proteínas sÒo de baixo peso molecular: Orosomucoide (40 kDa), apolipoproteína AI (28 kDa), zinco-alfa2-glicoproteína (43 kDa), fragmento do perlecan C-terminal LG3 (23 kDa), prostaglandina D2 sintase tipo-lipocalina (29 kDa) e inter-alfa inibidor de tripsina cadeia pesada H4 (35 kDa). Estas proteínas estÒo incluídas em estudos de falÛncia renal aguda, falÛncia renal cr¶nica, transplante renal, doenþa glomerular e doenþa maligna do trato urogenital. O método, nÒo invasivo, aproxima-se da tecnologia emergente da prote¶mica que permite a análise simultÔnea de várias proteínas urinárias como uma ferramenta para o diagnóstico e monitoraþÒo de uma variedade de doenþas humanas.(AU)

Contribution and perspectives of the impact of proteomics in study of placentas and embryonic and fetal membranes / Contribuição e perspectivas do impacto da proteômica em estudo de placentas e membranas embrionárias e fetais

Proteomic approaches have revolutionized the analysis of biological samples by allowing the identification of non-characterized protein expression and its role on protein interactions and post-translational modifications during embryonic development or as a consequence of pathological states. This new frontier of knowledge is, nowadays, an essential contribution to the elucidation of biological problems, by providing information that cannot be obtained by other target driven methods. This review highlights the new perspectives of proteomics studies based on bidimensional eletrophoresis (2D-PAGE) associated to mass spectrometry (MS) analytical methods of placenta, embryonic membranes and embryo evaluation, with emphasis on comparisons between normal and diseased tissues consequence of reproductive biotechnology manipulation.

Abordagens proteômicas revolucionaram a análise de amostras biológicas por permitir a identificação de padrões ainda não caracterizados de expressão de proteínas e/ou suas interações e modificações pós-traducionais em diferentes tecidos, como a placenta ou em embriões e fetos em diferentes estágios de desenvolvimento. Esta nova fronteira de conhecimento se constitui atualmente numa ferramenta fundamental para a elucidação de problemas biológicos, por fornecer informações que não podem ser obtidas por métodos mais focalizados, ou com alvos específicos. Essa revisão salienta as novas perspectivas geradas pela contribuição da proteômica baseada na eletroforese bidimensional (2D-PAGE) associada à espectrometria de massas (MS) para o estudo da placenta, das membranas embrionárias e do embrião, com ênfase nas comparações entre condições normais e aqueles provenientes de estados patológicos ou conseqüentes ao uso de biotecnologias reprodutivas.

Análise comparativa de mapas protéicos de amostras de soja convencionais e tolerantes ao herbicida glifosato visando à inocuidade alimentar / Comparative analysis of maps soy protein samples of conventional and tolerant to the herbicide glyphosate for food safety

A soja geneticamente modificada tolerante ao herbicida glifosato tem sido a cultura derivada da engenharia genética mais cultivada atualmente no mundo. Como todo alimento GM a soja tem sido alvo de investigação em relação a sua Biossegurança. Novas estratégias têm sido desenvolvidas e aplicadas neste campo de pesquisa, sendo que métodos rápidos e eficientes de análise proteômica têm sido utilizados para avaliação e monitoramento da segurança e inocuidade alimentar, indicando mudanças no perfil protéico entre variedades convencionais e GM. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os mapas protéicos de amostras de soja convencionais e suas derivadas geneticamente modificadas tolerantes ao herbicida glifosato, utilizando técnicas de análise proteômica com ênfase para inocuidade alimentar. Foram utilizadas seis amostras de soja, sendo três convencionais parentais e três derivadas GM, cultivadas entre 2004-2005, em Goiás. O extrato bruto protéico foi submetido à análise por eletroforese unidimensional e bidimensional. A eletroforese 2D, foi realizada utilizando tiras com gradiente de pH de 3-10 e 4-7. As imagens dos mapas protéicos das seis variedades, produzidas em replicatas, foram analisadas pelo software ImageMaster 2D Platinum. O potencial alergênico do extrato protéico bruto foi avaliado para todas as variedades utilizando soro de pacientes alérgicos à soja através de immunoblotting. Nos resultados obtidos observou-se a presença das principais frações protéicas da soja pela eletroforese unidimensional sem alteração significativa entre as amostras parentais e GM, exceto para uma banda de 115 kDa presente nas amostras parentais, mas ausente nas amostras GM. A partir da análise por eletroforese 2D foram identificadas as formas peptídicas correspondentes às frações de β-conglicinina e glicinina bem como diversas outras proteínas encontradas na soja como o inibidor de tripsina e a lipoxigenase. Através do software foi possível observar que um spot apresentou...

Genetically modified soya-tolerant to the herbicide glyphosate culture has been derived from the more cultivated genetic engineering in the world today. As GM soya beans whole food has been investigated in relation to your biosafety. New strategies have been developed and applied research in this field, and fast and efficient methods of analysis proteomics have been used for assessment and monitoring of food security and safety, indicating changes in own protein profile between conventional and GM varieties. The aim of this work was to assess the maps soy protein samples of conventional and genetically modified their derived to the herbicide glyphosate-tolerant, using Proteomics analysis techniques with emphasis on food safety. Six samples were used for conventional soya, three and three derived from GM parental, grown between 2004-2005. The crude protein extract own was subjected to analysis by electrophoresis one-dimensional and two-dimensional. 2D electrophoresis using Strip was held with pH gradient of 3-10 and 4-7. Protein maps images of six varieties produced in replicates have been analysed by the 2D Platinum software ImageMaster. The potential allergenic in crude protein extracts was evaluated for all varieties using allergic patient serum soya by immunoblotting. In the results obtained noted the presence of the main protein fractions of soya by one-dimensional electrophoresis without significant change between parental and GM samples, except for a band of 115 parental kDa present in the sample, but absent in GM samples. From the analysis by 2D electrophoresis peptides forms were identified corresponding to fractions of β-conglicinina and glicinina as well as several other proteins found in soy as trypsin inhibitor and lipoxygenase. Through the software has been possible to observe that a spot presented statistical difference between the samples tested, expressed in greater concentration in the samples GM in parenting. In tests of allergenicity, GM...

Determinação do perfil protéico da membrana externa da Leptospira interrogans sorovariedade Hardjoprajitno / Protein profile of the outer membrane of Leptospira interrogans serovar Hardjoprajitno

Estudou-se o perfil das proteínas da membrana externa (PME) da Leptospira interrogans sorovariedade Hardjoprajitno por meio da eletroforese bidimensional. Foram utilizadas técnicas de extração das PME com Triton x114 e precipitação com acetona. Os géis foram corados com nitrato de prata e as imagens analisadas para determinação da massa molecular das proteínas detectadas. Foram visualizadas 35 bandas protéicas, sendo que cinco delas se destacaram por estarem em maior quantidade: 22,54KDa (LipL22), 30/26KDa (LipL32), 34,41KDa (PME34), 42,75KDa (LipL41) e 58,59KDa (LipL63).(AU)

The protein profile of the outer membrane of Leptospira interrogans serovar Hardjoprajitno was determined by two-dimensional gel electrophoresis. The outer membrane was extracted with Triton x 114 and the proteins were precipitated with acetone. The images were analyzed for the determination of the molecular weight of the detected proteins. Thirty-five spots for the proteins that are predominant in the outer membrane of this Leptospira were observed and five proteins were found in higher quantities: 22.54KDa (LipL22), 30/26KDa (LipL32), 34.41KDa (PME34) (2), 42.75KDa (LipL41), and 58.59KDa (LipL63).(AU)

Determinação do perfil protéico da membrana externa da Leptospira interrogans sorovariedade Hardjoprajitno / Protein profile of the outer membrane of Leptospira interrogans serovar Hardjoprajitno

Estudou-se o perfil das proteínas da membrana externa (PME) da Leptospira interrogans sorovariedade Hardjoprajitno por meio da eletroforese bidimensional. Foram utilizadas técnicas de extração das PME com Triton x114 e precipitação com acetona. Os géis foram corados com nitrato de prata e as imagens analisadas para determinação da massa molecular das proteínas detectadas. Foram visualizadas 35 bandas protéicas, sendo que cinco delas se destacaram por estarem em maior quantidade: 22,54KDa (LipL22), 30/26KDa (LipL32), 34,41KDa (PME34), 42,75KDa (LipL41) e 58,59KDa (LipL63).

The protein profile of the outer membrane of Leptospira interrogans serovar Hardjoprajitno was determined by two-dimensional gel electrophoresis. The outer membrane was extracted with Triton x 114 and the proteins were precipitated with acetone. The images were analyzed for the determination of the molecular weight of the detected proteins. Thirty-five spots for the proteins that are predominant in the outer membrane of this Leptospira were observed and five proteins were found in higher quantities: 22.54KDa (LipL22), 30/26KDa (LipL32), 34.41KDa (PME34) (2), 42.75KDa (LipL41), and 58.59KDa (LipL63).

Proteômica e sepse: novas perspectivas para o diagnóstico / Proteomics and sepsis: new perspectives for diagnosis

JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS: O diagnóstico e o tratamento da sepse continuam a desafiar a todos; e desenvolver formas mais precisas de abordagem são absolutamente necessárias. O objetivo deste estudo foi empregar técnicas proteômicas, eletroforese bidimensional e espectrometria de massa, para verificar a expressão diferencial de proteínas, em soro de pacientes com sepse comparado com controles saudáveis. MÉTODO: Amostras de soro de 30 pacientes com sepse, causada por vários tipos de microorganismos e de 30 controles saudáveis foram obtidas para análise. A seguir, foram submetidas a 2D-SDS-PAGE, comparação entre géis, seleção de spots para excisão e digestão com tripsina, sendo os peptídeos analisados por MALDI TOF-TOF. Os espectros obtidos foram processados (Mascot-matrixscience) para identificação de proteínas no NCBInr Data Bank. RESULTADOS: A análise das imagens mostrou vários spots com expressão diferencial nos géis dos pacientes com sepse em relação aos controles. A identificação de proteínas em alguns destes spots encontrou: precursor Orosomucoide 1, Apolipoproteína A-IV, precursor Apolipoproteína A-IV, precursor Haptoglobina, Haptoglobina, proteína Zinc finger, Amilóide sérico A-1, Transtiretina, Nebulin, Complemento C4, Alfa1-Antitripsina, produto protéico não nominado e outros. CONCLUSÕES: Soros de pacientes com diferentes tipos de sepse expressam padrão protéico característico por 2D-SDS-PAGE comparado com controles. A maior expressão foi de proteínas de fase aguda e lipoproteínas. É possível que no futuro, com a proteômica, criar painel diagnóstico de proteínas, encontrar novos biomarcadores e alvos para intervenção terapêutica na sepse. Esta é a primeira descrição, com a proteômica, das alterações na expressão protéica, no soro de pacientes com sepse.

BACKGROUND AND OBJECTIVES: The diagnostic and treatment of sepsis continue to challenger all, and, more specific forms to approach are absolutely necessary. The objective of this study was to use proteomics techniques, two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry, to verify the differential protein expression between serum of patients with sepsis and health controls. METHODS: Samples of serum the 30 patients with sepsis, caused for different types of microorganisms and serum of 30 health controls were obtained for analysis. Next, were submitted to 2D-SDS-PAGE, gels compared, selection of spots for excision and digestion with trypsin, being the peptides analyzed for MALDI TOF-TOF. The obtained spectrums were processed (Mascot-matrix science) for protein identification in NCBInr Data Bank. RESULTS: Image analyses showed several spots with differential expressions in the gels of the patients with sepsis in relation to the controls. The protein identification of some of these spots founded: Orosomucoid 1 precursor, Apolipoprotein A-IV, Apolipoprotein A-IV precursor, Haptoglobin protein precursor, Haptoglobin, Zinc finger protein, Serum amyloid A-1, Transthyretin, Nebulin, Complement C4, Alpha1-Antitrypsin, Unnamed protein product and others. CONCLUSIONS: Serum of the patients with different types of sepsis express characteristic protein profiles by 2D-SDS-PAGE compared with controls. The most expressed were from acute phase proteins and lipoproteins. It is possible in the future, with proteomics, create diagnostic panel of proteins, finding news biomarkers and targets for therapeutic interventions in sepsis. This is a first description, with proteomics, of the alterations in protein expression, in serum of the patients with sepsis.

Imunoidentification of Albumin and Osteopontin in Seminal Plasma of Taurine and Zebuine Bulls / Imunoidentificação de Albumina e Osteopontina no Plasma Seminal de Reprodutores Taurinos e Zebuínos

Two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis was performed in seminal plasma of seven Bos taurus taurus and seven Bos taurus indicus bulls with high semen freezability, from an artificial insemination center. In a 8% polyacrylamide gels, three bands of 195, 66 and 55 kDa, present in 100% of the samples in both sub-species, were analyzed by their optical densities. In Bos taurus samples, the opticals densities of 55 kDa band, imunoidentified as osteopontin were superior (p < 0.05) than Bos indicus samples. The 66 kDa band was imunoidentified as albumin. In the Bos taurus samples, the bands did not show any variation among the bull samples, but in the Bos indicus, the albumin optical densities showed significant variation among samples.

As proteínas do plasma seminal de 14 reprodutores (7 Bos taurus taurus e 7 Bos taurus indicus), foram analisadas por eletroforese bidimensional, em géis de poliacrilamida a 8%, corados por Comassie Blue. Três bandas protéicas, presentes em 100% das amostras de plasma seminal, foram quantificadas de acordo com a densidade óptica exibida: 195 kDa, pI 6,5-7,5 ; 66 kDa, pI 5,4 e 55 kDa, pI 4,5. As amostras de plasma seminal provenientes de taurinos apresentaram densidades ópticas significativamente superiores (p < 0,05) às dos zebuínos na banda

Imunoidentification of Albumin and Osteopontin in Seminal Plasma of Taurine and Zebuine Bulls / Imunoidentificação de Albumina e Osteopontina no Plasma Seminal de Reprodutores Taurinos e Zebuínos

Two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis was performed in seminal plasma of seven Bos taurus taurus and seven Bos taurus indicus bulls with high semen freezability, from an artificial insemination center. In a 8% polyacrylamide gels, three bands of 195, 66 and 55 kDa, present in 100% of the samples in both sub-species, were analyzed by their optical densities. In Bos taurus samples, the opticals densities of 55 kDa band, imunoidentified as osteopontin were superior (p 0.05) than Bos indicus samples. The 66 kDa band was imunoidentified as albumin. In the Bos taurus samples, the bands did not show any variation among the bull samples, but in the Bos indicus, the albumin optical densities showed significant variation among samples.

As proteínas do plasma seminal de 14 reprodutores (7 Bos taurus taurus e 7 Bos taurus indicus), foram analisadas por eletroforese bidimensional, em géis de poliacrilamida a 8%, corados por Comassie Blue. Três bandas protéicas, presentes em 100% das amostras de plasma seminal, foram quantificadas de acordo com a densidade óptica exibida: 195 kDa, pI 6,5-7,5 ; 66 kDa, pI 5,4 e 55 kDa, pI 4,5. As amostras de plasma seminal provenientes de taurinos apresentaram densidades ópticas significativamente superiores (p 0,05) às dos zebuínos na banda