RESUMO
Snakebites constitute an important public health problem, recognized by World Health Organization. In Brazil, Bothrops genus snakes are responsible for the major number of registered envenomation cases. Among this genus, the species B. moojeni is known for the severity of local inflammatory response. However, systemic repercussions of bothropic envenomation are still not well stablished. In this context, adipose tissue is a metabolically active organ, known for producing many proinflammatory mediators. Preadipocytes and adipocytes are important cell types that constitute this tissue and possess the capacity of synthetize components that drive to inflammation. Therefore, this study aims to investigate the effects of B. moojeni whole venom (BmV), in cultured preadipocytes, with focus on: i) release of cytokines and chemokines (TNF-α, IL-6, IL-10, MCP-1 and KC); ii) release of prostaglandin E2 (PGE2); iii) protein expression of cyclooxygenase-1 and -2 (COX-1 and -2); iv) participation of COX-1, -2, and PGE2 receptors (EP1-4) on PGE2 release; v) activation of transcription factor NF-κB; vi) participation of NF-κB on PGE2 release and COX-2 protein expression; and vii) preadipocytes differentiation into mature adipocytes. Moreover, the venom effects in adipocytes were investigated, focusing on: i) PGE2 release and ii) COX-2 protein expression. In order to this, 3T3-L1 preadipocytes were cultured in DMEM medium, with 10% BFS, 1% L-glutamine and antibiotics until confluence. Next, they were incubated with DMEM only, or TNF-α (20 ng/mL), or BmV (1 μg/mL) for different experimental periods of time. TNF-α, IL-6, IL- 10, MCP-1, KC and PGE2 concentration, in supernatants, was evaluated by ELISA. COX-1, -2, and P-NF-κB protein expression was determined by Western blotting analysis. COX-1, -2, EP1-4 receptors and NF-κB participation on PGE2 release were evaluated utilizing pharmacological treatments with specific inhibitors and/or antagonists. BmV effect on preadipocytes differentiation into mature adipocytes was evaluated according to protocol previously described in literature. Taken together, results obtained show that BmV activates proinflammatory pathways in preadipocytes and mature adipocytes. This venom acts on these cells stimulating the synthesis of cytokines that regulate inflammation (IL-6 and IL-10), or that possess chemotactic activity (KC), besides PGE2. Moreover, BmV was capable of activating mature adipocytes to PGE2 synthesis. In preadipocytes, COX-1 and -2 and EP1 receptor are important factors of venom-induced mechanisms involved in PGE2 release, with COX-2 protein expression increased in this process. It was also demonstrated NF-κB participation in PGE2 synthesis by preadipocytes. Finally, BmV is able to enhance preadipocytes differentiation into mature adipocytes. Taken together, this work indicates that adipose tissue cells are targets for BmV and must collaborate to the biosynthesis of inflammatory mediators involved in bothropic envenoming pathophysiology.
Os acidentes ofídicos constituem um importante problema de saúde pública, reconhecido pela Organização Mundial da Saúde. No Brasil, as serpentes do gênero Bothrops são responsáveis pelo maior número de envenenamentos registrados. Dentro deste gênero, a espécie B. moojeni é conhecida pela gravidade da resposta inflamatória exacerbada, no local da picada. No entanto, as repercussões sistêmicas do envenenamento botrópico, em diferentes tecidos, ainda não são bem estabelecidas. Neste contexto, o tecido adiposo é um órgão metabolicamente ativo, conhecido por produzir diversos mediadores pró-inflamatórios. Os pré-adipócitos e adipócitos são importantes tipos celulares que constituem este tecido e possuem a capacidade de sintetizar componentes que conduzem à inflamação. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos do veneno bruto de B. moojeni (VBm), em pré-adipócitos, em cultura, quanto a: i) liberação de citocinas e quimiocinas (TNF-α, IL-6, IL-10, MCP-1 e KC); ii) liberação de prostaglandina E2 (PGE2); iii) expressão proteica de ciclo-oxigenases-1 e -2 (COX-1 e -2); iv) participação das COX-1 e -2, e dos receptores de PGE2 (EP1-4) na liberação de PGE2; v) ativação do fator de transcrição NF-κB; vi) participação do NF-κB na liberação de PGE2 e na expressão proteica de COX-2; e vii) diferenciação de pré- adipócitos em adipócitos maduros. Ainda, o efeito do veneno em adipócitos foi investigado quando à: i) liberação de PGE2 e ii) expressão proteica de COX-2. Pré- adipócitos da linhagem 3T3-L1 foram cultivados em meio DMEM, contendo 10% de SFB, 1% de L-glutamina e antibiótico até a confluência. Em seguida, foram incubados com apenas DMEM, ou TNF-α (20 ng/mL), ou VBm (1 μg/mL) por diferentes períodos de tempo experimentais. A concentração de TNF-α, IL-6, IL-10, MCP-1 e KC, nos sobrenadantes, foi avaliada por ELISA. A expressão proteica de COX-1 e -2 e P-NF-κB foi determinada por Western blotting. A participação das COX-1 e -2, dos receptores EP1-4 e do NF-κB na liberação de PGE2 foi avaliada utilizando-se inibidores e/ou antagonistas específicos. O efeito do VBm na diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos maduros foi avaliada seguindo protocolo descrito na literatura. Em conjunto, os resultados obtidos evidenciaram que o VBm ativa vias pró-inflamatórias em pré-adipócitos e adipócitos maduros. Este veneno atua sobre estas células estimulando a síntese de citocinas, que regulam a inflamação (IL-6 e IL-10), ou possuem atividade quimiotáxica (KC), além de PGE2. Além disso, o VBm foi capaz de ativar adipócitos maduros para a síntese de PGE2. Em pré-adipócitos, as COX-1 e -2 e o receptor EP1 são fatores importantes nos mecanismos desencadeados pelo veneno, que acarretam a liberação de PGE2, sendo que a COX-2 tem sua expressão proteica aumentada neste processo. Também foi demonstrada a participação do NF-κB na síntese de PGE2 em pré- adipócitos. Por fim, o VBm é capaz de aumentar a diferenciação de PAds em adipócitos maduros, provavelmente através dos mecanismos antilipolíticos da PGE2. Em conclusão, este trabalho aponta que as células do tecido adiposo são alvos do VBm e devem colaborar para a biossíntese de mediadores inflamatórios, envolvidos na fisiopatologia do envenenamento botrópico.