High expression of SGK1 in thrombosis of acute ST-segment elevation myocardial infarction: Based on proteomics analysis of intracoronary thrombosis.

INTRODUCTION AND OBJECTIVES: Thrombosis is involved in the onset and progression of ST-segment elevation myocardial infarction (STEMI). The aim of this study was to explore the expression level of serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 (SGK1) in intracoronary thrombus and the relationship between them. METHODS: We identified 30 patients who received treatment in the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University between May 2018 to May 2020 and who underwent thrombus aspiration and percutaneous coronary intervention for ST-segment-elevation myocardial infarction. Additionally, we selected 30 patients with normal coronary angiography for the control group. We analyzed thrombus protein expression profiling by combining tandem mass tag labeling, high-performance liquid chromatography fractionation and mass spectrometry quantification approach. RESULTS: The differentially regulated protein profiles revealed the alteration of serine-threonine/tyrosine-protein kinase, which was upregulated significantly in the experimental group. We selected SGK1 downstream factor for validation and found that the expression of SGK1 in the thrombus of STEMI was significantly increased. Immunohistochemistry (IHC) showed significantly increased expression of SGK1 in the thrombus of STEMI patients compared with the control group (17.21±2.36 vs. 4.14±1.17%, p<0.05). Similar findings were observed in the Western blot analysis (p<0.05). IHC showed that SGK1 expressed in a region similar to that of the platelets. CONCLUSION: This is the first quantitative proteomics study to assess thrombus in patients with STEMI. The expression of SGK1 in thrombus was significantly higher in patients with acute STEMI than in the control group. SGK1 might be involved in the platelet physiological process.

Proteomic analysis identifies molecular players and biological processes specific to SARS-CoV-2 exposure in endothelial cells

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) has been responsible for the severe pandemic of acute respiratory disease, coronavirus disease 2019 (COVID-19), experienced in the 21st century. The clinical manifestations range from mild symptoms to abnormal blood coagulation and severe respiratory failure. In severe cases, COVID-19 manifests as a thromboinflammatory disease. Damage to the vascular compartment caused by SARS-CoV-2 has been linked to thrombosis, triggered by an enhanced immune response. The molecular mechanisms underlying endothelial activation have not been fully elucidated. We aimed to identify the proteins correlated to the molecular response of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) after exposure to SARS-CoV-2, which might help to unravel the molecular mechanisms of endothelium activation in COVID-19. In this direction, we exposed HUVECs to SARS-CoV-2 and analyzed the expression of specific cellular receptors, and changes in the proteome of HUVECs at different time points. We identified that HUVECs exhibit non-productive infection without cytopathic effects, in addition to the lack of expression of specific cell receptors known to be essential for SARS-CoV-2 entry into cells. We highlighted the enrichment of the protein SUMOylation pathway and the increase in SUMO2, which was confirmed by orthogonal assays. In conclusion, proteomic analysis revealed that the exposure to SARS-CoV-2 induced oxidative stress and changes in protein abundance and pathways enrichment that resembled endothelial dysfunction.

Avaliação do perfil de microRNAs exossomais em portadores de hipercolesterolemia familial / Evaluation of the profile of exosomal microRNAs in patients with familial hypercholesterolemia

A Hipercolesterolemia Familial (HF) é uma doença hereditária do metabolismo lipídico que causa aos portadores alta incidência de aterosclerose prematura. A HF pode ser diagnosticada clínica e geneticamente, entretanto, apenas cerca de 40% podem ter confirmados pelo diagnostico molecular. Assim, outros sistemas de diagnóstico devem ser avaliados. Ultimamente devido a estabilidade em fluidos biológicos, os exossomos circulantes apresentam grande potencial, pois carreiam um número variado de compostos e são considerados veículos de intercomunicação entre os tecidos. Sabe-se que vários RNAs são carreados nos exossomos, incluindo miRNAs, lncRNA e uma variedade de proteínas. Estes componentes podem ser marcadores de diagnóstico para várias doenças inclusive a HF e suas complicações cardiovasculares. Foram utilizadas amostras de exossomos plasmáticos provenientes de 54 pacientes HF sem uso de estatina por, no mínimo, seis semanas, e 38 indivíduos normolipidêmicos para sequenciamento de miRNAs e estudo da proteômica. Os exossomos foram isolados utilizando dois métodos precipitação química e cromatográfica de exclusão de tamanho e caraterizados utilizando: dispersão de luz dinâmica, Western blotting, rastreamento de nanopartículas (NanoSight), imunomarcação e microscopia eletrônica de transmissão. Os miRNAs e proteínas foram extraídos dos exossomos e analisados por sequenciamento de nova geração e espectrometria de massa, respectivamente. Os dados clínicos, biodemográficos e laboratoriais dos pacientes HF e controles indicaram diferenças significativas esperadas entre os grupos, indicando que foram selecionados adequadamente. A caracterização físico-química dos exossomos mostrou resultados com tamanho de ˜90nm e imunorreação positiva para tetraspaninas. O resultado do sequenciamento identificou acima 2000 miRNAs. Os miR-122- 5p e miR-21-5p apresentaram expressão aumentada no grupo HF (log2FC=1,79 e log2FC=1,27, respectivamente), e o miR-122-5p pós normalização em relação ao controle manteve significativo comparados ao controle (p=0,034). A análise comparativa entre exossomos e plasma total mostrou diferença significativa, pois foram identificadas 239 proteínas (p <0,05) diferentes entre exossomos e plasma. Em exossomos, 17 proteínas foram aumentadas e 21 diminuídas em pacientes com HF em comparação com o controle (p <0,05). Destas, seis proteínas foram mais abundantes em HF e sete proteínas foram menos abundantes em exossomos de pacientes com HF em comparação com o controle. A análise de enriquecimento por bioinformática mostrou que a maior parte dessas moléculas (miRNAs e proteínas) foram relacionadas com metabolismo lipídico, dislipidemia, aterosclerose, doença arterial coronariana, adipogênese. Assim, na busca de novos alvos como potenciais biomarcadores de diagnóstico da HF, nossos resultados da análise integrativa entre os miRNAs e as proteínas exossomais abre novas frentes de pesquisa mais bem direcionadas, para a validação desses miRNAs e proteínas exossomais

Familial Hypercholesterolemia (FH) is an inherited disease of lipid metabolism that causes a high incidence of premature atherosclerosis in patients. FH can be diagnosed clinically and genetically, however, only about 40% can be confirmed by molecular diagnosis. Thus, other diagnostic systems should be evaluated. Lately, due to stability in biological fluids, circulating exosomes have great potential, as they carry a varied number of compounds and are considered vehicles of intercommunication between tissues. Several RNAs are known to be carried on exosomes, including miRNAs, lncRNA, and a variety of proteins. These components can be diagnostic markers for several diseases including FH and its cardiovascular complications. Plasma exosome samples from 54 FH patients without statin use for at least six weeks and 38 normolipidemic individuals were used for miRNA sequencing and proteomics studies. Exosomes were isolated using two methods chemical precipitation and size exclusion chromatography and characterized using: dynamic light scattering, Western blotting, nanoparticle tracking (NanoSight), immunostaining and transmission electron microscopy. MiRNAs and proteins were extracted from exosomes and analyzed by next-generation sequencing and mass spectrometry, respectively. Clinical, biodemographic and laboratory data of FH patients and controls indicated significant expected differences between the groups, indicating that they were appropriately selected. The physicochemical characterization of exosomes showed results with a size of ˜90nm and positive immunoreaction for tetraspanins. The sequencing result identified above 2000 miRNAs. miR-122-5p and miR-21-5p showed increased expression in the FH group (log2FC=1.79 and log2FC=1.27, respectively), and miR122-5p after normalization in relation to the control remained significant compared to the control (p=0.034). The comparative analysis between exosomes and total plasma showed a significant difference, as 239 different proteins (p < 0.05) were identified between exosome and plasma. In exosomes, 17 proteins were increased and 21 decreased in FH patients compared to control (p < 0.05). Of these, six proteins were more abundant in FH and seven proteins were less abundant in exosomes from patients with FH compared to the control. Bioinformatics enrichment analysis showed that most of these molecules (miRNAs and proteins) were related to lipid metabolism, dyslipidemia, atherosclerosis, coronary artery disease, adipogenesis. Thus, in the search for new targets as potential diagnostic biomarkers of FH, our results of the integrative analysis between miRNAs and exosomal proteins opens new and better-directed research fronts for the validation of these miRNAs and exosomal proteins

Analytical methods for assessing changes induced by gamma exposure in an animal model

SUMMARY OBJECTIVE: Ionizing radiation can cause radio-induced changes in the cellular metabolome due to the breakdown of DNA bonds. Our goal was to find the early tissue response to radiation exposure supported by distinct analytical methods. METHODS: Histological analyses were performed on the organs extracted from rats to search for microscopic changes. The histological slides stained with hematoxyline-eosin (HE) were analyzed in magnification (40x). Subsequently, the tissues were subjected to mass spectrometry that allowed molecular analysis and DESI-MSI that generated the molecular image of lipids, assessing changes in intensities, especially in the brain. RESULTS: The histological analysis found nonspecific inflammatory changes; no areas of fibrosis, necrosis, or apoptosis were identified, suggesting non-morphological tissue alterations. However, the DESI-MSI images of brain lipids allowed the observation of many radio-induced changes in the lipid's intensities. CONCLUSIONS: No early radio induced histological or mass weight changes in the radiation exposed rats could be observed at 5 Gy. However, early changes in the molecular level were observed in the DESI-MSI images of the brain lipids. The DESI-MSI method proved to be efficient and relevant, allowing a regional molecular analysis of the tissues, expanding a new field of study that is still in its infancy: radiometabolomics.

RESUMO OBJETIVO: Radiação ionizante pode causar alterações no metaboloma celular devido à quebra de ligações no DNA. O objetivo deste trabalho foi evidenciar a resposta aguda tecidual induzida pela exposição da radiação ionizante. MÉTODOS: Análises histológicas foram realizadas nos órgãos extraídos de ratos para análise de alterações microscópicas. As lâminas histológicas coradas com hematoxilina eosina (HE) foram analisadas em aumento (40x). Posteriormente, os tecidos foram submetidos a espectrometria de massa, que permitiu análise molecular e o Desi-MSI que gerou imagem molecular de lipídios, identificando alterações na intensidade, principalmente no cérebro. RESULTADOS: As análises histológicas encontraram alterações inflamatórias inespecíficas, nem áreas de fibrose, necrose ou apoptose, sugerindo ausência de alterações morfológicas. As imagens de lipídios cerebrais obtidas por Desi-MSI permitiram observar as inúmeras alterações na intensidade nas seções teciduais do encéfalo. CONCLUSÕES: Alterações agudas radioinduzidas de massa do órgão e histológicas nos órgãos dos ratos expostos não puderam ser observadas a 5 Gy. Entretanto, mudanças em nível molecular foram observadas nas imagens de Desi-MSI dos lipídios cerebrais. O método Desi-MSI mostrou-se eficiente e relevante, permitindo a análise molecular regi-onal dos tecidos no SNC, expandindo um novo campo de estudo que ainda está em sua infância: a radiometaboloma.

Influence of EPICardial adipose tissue in HEART diseases (EPICHEART) study: Protocol for a translational study in coronary atherosclerosis.

INTRODUCTION: Accumulation of epicardial adipose tissue (EAT) is associated with coronary artery disease (CAD) and increased risk of coronary events in asymptomatic subjects and low-risk patients, suggesting that EAT promotes atherosclerosis in its early stage. Recent studies have shown that the presence of CAD affects the properties of adjacent EAT, leading to dynamic changes in the molecular players involved in the interplay between EAT and the coronary arteries over the history of the disease. The role of EAT in late-stage CAD has not been investigated. OBJECTIVES: In a comparative analysis with mediastinal and subcutaneous adipose tissue, we aim to investigate whether the volume of EAT assessed by computed tomography and its proteome assessed by SWATH-MS mass spectrometry are associated with late stages of CAD in an elderly cohort of severe aortic stenosis patients. METHODS: The EPICHEART study (NCT03280433) is a prospective study enrolling patients with severe degenerative aortic stenosis referred for elective aortic valve replacement, whose protocol includes preoperative clinical, nutritional, echocardiographic, cardiac computed tomography and invasive coronary angiographic assessments. During cardiac surgery, samples of EAT and mediastinal and subcutaneous thoracic adipose tissue are collected for proteomics analysis by SWATH-MS. In addition, pericardial fluid and peripheral and coronary sinus blood samples are collected to identify circulating and local adipose tissue-derived biomarkers of CAD. CONCLUSION: We designed a translational study to explore the association of EAT quantity and quality with advanced CAD. We expect to identify new biochemical factors and biomarkers in the crosstalk between EAT and the coronary arteries that are involved in the pathogenesis of late coronary atherosclerosis, especially coronary calcification, which might be translated into new therapeutic targets and imaging tools by biomedical engineering.

Bisfenol-A: cuantificacion en orina de mujeres embarazadas por cromatografia gaseosa-espectrometria de masa / Bisfenol-A: quantification in urine of pregnant women by gas chromatography-mass spectrometry / Bisfenol-A: quantificacao em urina de gestantes por cromatografia gasosa-espectrometria de massa

El uso de bisfenol-A (BPA) a nivel de la industria global se ha venido incrementando en los ultimos anos, y fueron los mercados emergentes los impulsores de esta demanda creciente. Las aplicaciones de BPA en la industria de los alimentos y bebidas representan solo del 3 al 4% del consumo global de policarbonato, pero su uso esta siendo reexaminado debido a que se conocieron varios trabajos cientificos que indican la existencia de una relacion directa entre el BPA y los efectos adversos para la salud. La contaminacion de los alimentos y bebidas se produce por migracion del BPA desde los envases que los contienen (alimentos enlatados, vinos, etc.), y es la principal fuente de exposicion en el humano. Para evaluar dicha exposicion se desarrollo y valido un metodo analitico por cromatografia gaseosa acoplada a espectrometria de masa para la cuantificacion de BPA total en orina de mujeres embarazadas atendidas en el Hospital Italiano de Buenos Aires en el ano 2013, con un limite de cuantificacion de 2,0 ng/mL y un limite de deteccion de 0,8 ng/mL. De las 149 muestras de orina analizadas, el 66,4% fueron cuantificables, con la mediana de BPA total de 4,8 ng/mL (4,3 ng/mg de creatinina) y la media geometrica de 4,8 ng/mL (4,7 ng/mg de creatinina).

The use of bisphenol-A (BPA) at the level of the global industry has been increasing in recent years, with emerging markets being the drivers of this growing demand. BPA applications in the food and beverage industry represent only 3 to 4% of the global consumption of polycarbonate, but its use is being reexamined because several scientific works were reported indicating the existence of a direct relationship between BPA and adverse effects on health. The contamination of food and beverages is produced by the migration of BPA from the containers that hold them (canned foods, wines, etc.) and it is the main source of exposure in humans. To evaluate this exposure, an analytical method was developed by gas chromatography coupled to mass spectrometry for the quantification of total BPA in urine of pregnant women treated at the Hospital Italiano de Buenos Aires in 2013, with a limit of quantification of 2.0 ng/mL and of detection of 0.8 ng/mL. Of the 149 urine samples analyzed, 66.4% were quantifiable, with a median total BPA of 4.8 ng/mL (4.3 ng/mg creatinine) and a geometric mean of 4.8 ng/mL (4.7 ng/mg creatinine).

O uso de bisfenol-A (BPA) ao nivel da industria global foi aumentando nos ultimos anos, e foram os mercados emergentes que deram impulso a essa demanda crescente. As aplicacoes de BPA na industria de alimentos e bebidas representam apenas 3 a 4% do consumo global de policarbonato, mas seu uso esta sendo reexaminado visto que varios trabalhos cientificos indicando a existencia de uma relacao direta entre o BPA e os efeitos adversos na saude foram conhecidos. A contaminacao dos alimentos e bebidas e produzida pela migracao de BPA das embalagens que os contem (alimentos enlatados, vinhos, etc.) e e a principal fonte de exposicao em humanos. Para avaliar esta exposicao, foi desenvolvido e avaliado um metodo analitico por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas para a quantificacao do BPA total na urina de gestantes atendidas no Hospital Italiano de Buenos Aires em 2013, com um limite de quantificacao de 2,0 ng/mL e um limite de deteccao de 0,8 ng/mL. Das 149 amostras de urina analisadas, 66,4% foram quantificaveis, com uma mediana de BPA total de 4,8 ng/mL (4,3 ng/mg de creatinina) e a media geometrica de 4,8 ng/mL (4,7 ng/mg de creatinina).

Improved method for diagnosis of Nerium oleander poisoning in necropsy tissues / Método aprimorado para diagnóstico da intoxicação por Nerium oleander em tecidos de necropsia

Nerium oleander is an ornamental cardiotoxic plant found in tropical and subtropical areas of the World. Its toxicity is related to the content of cardioactive glycosides, mainly oleandrin, found throughout the plant. The present study aimed to describe a new and improved method for oleandrin detection in tissue samples. The determination of oleandrin was made after extraction with a modified QuEChERS technique and measurement by UFLC-MS/MS. A total of 36 guinea pigs (Cavia porcellus) were distributed into 3 groups (n=12): control group that received only water orally (CON), and two treated groups that received hydroalcoholic oleander extract at doses of 150mg.kg-1 (OLE 150) and 300mg.kg-1 (OLE 300) in single oral dose. After three hours, fragments of heart, kidneys, liver and brain were collected for determination of oleandrin levels. The extraction and chromatographic procedures were effective for oleandrin detection and quantification in tissues, with retention time of 1.2 min and detection limit of 0.001μg g-1. The chromatographic analysis of treated guinea pigs indicated that oleandrin is distributed equally among the analyzed tissues. The developed methodology is a reliable, effective and rapid form of diagnosis of N. oleander poisoning based on necropsy tissue samples.(AU)

Nerium oleander é uma planta cardiotóxica ornamental encontrada em áreas tropicais e subtropicais do mundo. Sua toxicidade é relacionada á presença de glicosídeos cardioativos, principalmente a oleandrina, encontrada em toda a planta. O presente estudo objetiva descrever um novo e aprimorado método para detecção da oleandrina em amostras de tecido. A determinação da oleandrina foi feita após extração utilizando técnica modificada de QuEChERS e mensuração por UFLC-MS/MS. Um total de 36 cobaios (Cavia porcellus) foi distribuído em três grupos (n=12): grupo controle que recebeu apenas água por via oral (CON), e dois grupos tratados que receberam extrato hidroalcóolico de oleander nas doses de 150mg.kg-1 (OLE 150) e 300mg.kg-1 (OLE 300) em uma única dose oral. Após três horas, fragmentos do coração, rins, fígado e cérebro foram coletados para determinação dos níveis de oleandrina. A extração e procedimentos cromatográficos foram eficientes na detecção e quantificação da oleandrina nos tecidos, com tempo de retenção de 1,2min e limite de detecção de 0,001μg g-1. A análise cromatográfica dos animais tratados indicou que a oleandrina é distribuída de forma equalizada pelos tecidos analisados. A metodologia desenvolvida representa uma forma de diagnóstica segura, efetiva e rápida da intoxicação por N. oleander a partir de amostras de tecidos de necropsia.(AU)

Método cualitativo rápido ( screening ) para ladetección de residuos de plaguicidas en frutas y hortalizas / Qualitative screening method for pesticide residues detection in fruits and vegetables / Método qualitativo rápido (screening) para a detecção de resíduos de pesticidas nas frutas e nos vegetais

Resumen Debido a la importancia de desarrollar metodologías que permitan el análisis de los residuos agrícolas, el presente trabajo validó un método cualitativo rápido (screening) para el análisis de residuos de plaguicidas en frutas y hortalizas. La metodología se basó en el método de extracción QuEChERS, versión europea, con un paso adicional de limpieza por cromatografía de permeación por gel (GPC), lo cual permitió reducir la cantidad de componentes de la matriz en el extracto final. El análisis fue realizado por cromatografía de gases/espectrometría de masas con un analizador cuadrupolo simple. La metodología resultó adecuada para el análisis cualitativo de 31 plaguicidas a su respectivo límite máximo de residuos. Los resultados en muestras reales fueron consistentes respecto a una metodología cuantitativa de rutina, por ende, la metodología resultó ser una buena alternativa para el análisis rápido de estos contaminantes.

Abstract Because of the importance of developing methodologies that allow agricultural residues analysis, a rapid screening qualitative method for the determination of pesticides residues in fruits and vegetables was validated. The methodology was based on the European QuEChERS extraction method with an additional cleaning step by gel permeation chromatography (GPC), which helped to reduce the number of matrix components in the final extract. The analysis was carried out by gas chromatography coupled to mass spectrometry with a single quadrupole analyzer. The methodology was appropriate for the qualitative analysis of 31 pesticides at their respective maximum residue limits. Consistent results were obtained with respect to a quantitative routine methodology in the analysis of real samples, hence the methodology was proven to be a good alternative for the fast analysis of these contaminants in fruits and vegetables.

Resumo Devido à importância de desenvolver metodologias que permitam analisar os resíduos agrícolas, o presente trabalho validou de um método qualitativo rápido (screening) para a análise de resíduos de pesticidas nas frutas e vegetais. A metodologia foi baseada no método de extração QuEChERS versão Europeia com um passo adicional de limpeza por meio de cromatografia de permeação em gel (GPC), o que permitiu reduzir a quantidade de componentes de matriz no extrato final. A análise foi realizada por cromatografia gasosa/espectrometria de massa com um analisador de quadrupolo simples. A metodologia foi adequada para a análise qualitativa de 31 pesticidas aos seus respectivos limites máximos de resíduos. Os resultados obtidos em amostras reais foram consistentes com uma metodologia quantitativa de rotina, portanto, a metodologia estudada tem demonstrado ser uma boa alternativa para a análise rápida destes contaminantes em frutas e vegetais.

Cuantificación de Bisfenol-A libre en sangre de cordón umbilical humano a nivel de trazas / Quantification of free Bisphenol-A in human umbilical cord blood at trace level / Quantificação de Bisfenol-A livre em sangue de cordão umbilical humano a nível de traços

El Bisfenol-A (BPA) es ampliamente utilizado en la producción de plásticos de policarbonato, por lo que está presente en productos de uso masivo. Es un disruptor endócrino e incide en el desarrollo gonadal y del sistema nervioso central. La exposición de mujeres embarazadas al BPA es particularmente preocupante para el feto en desarrollo, debido a que atraviesa la placenta pasando a la sangre de cordón y al líquido amniótico. Esto se suma a la escasa o nula actividad enzimática fetal para biotransformarlo en BPA-glucurónido inactivo, causando posibles efectos nocivos a la descendencia a dosis muy bajas y sostenidas. Con el propósito de estudiar la exposición al BPA y sus efectos en la población de Argentina se desarrolló y validó un método analítico por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masa, que permite la cuantificación de trazas de BPA libre (forma estrogénica, activa) en plasma de cordón umbilical. La técnica consiste en la precipitación de proteínas de la sangre de cordón por agregado de acetonitrilo y posterior centrifugado e inyección del sobrenadante. Se utilizó una elución isocrática en la cromatografía líquida, y la espectrometría de masa se realizó empleando Electrospray negativo en modo de monitoreo de reacciones múltiples. Los valores de BPA libre cuantificados están en el rango de 1,0 a 12,1 ng/mL, límite de detección: 0,6 ng/mL.

Bisphenol-A (BPA) is widely used in the production of polycarbonate plastics and therefore, it is present in products of massive use. It is known as an endocrine disruptor and has an impact on gonadal and central nervous system development. Exposure of pregnant women to BPA is particularly worrying for the developing fetus because it crosses the placenta into the cord blood and amniotic fluid, coupled with little or no fetal enzymatic activity to biotransform it into inactive BPA-glucuronide, causing possible harmful effects to the offspring at very low and sustained doses. With the aim to study the exposure to BPA and its effects on the population of Argentina, an analytical method was developed and validated by liquid chromatography coupled to mass spectrometry, which allows the quantification of trace amounts of free BPA (estrogenic, active form) in plasma of umbilical cord. The method involves protein precipitation by the addition of acetonitrile and subsequent centrifugation and injection of supernatant. An isocratic elution was used in liquid chromatography, and mass spectrometry was performed using negative Electrospray mode in multiple reaction monitoring. Quantified free BPA values are in the range of 1.0 to 12.1 ng/mL, Detection Limit: 0,6 ng/mL.

O Bisfenol-A (BPA) é amplamente utilizado na produção de plásticos de policarbonato, portanto está presente em produtos de uso massiço. Ele é um disruptor endócrino e tem um impacto no desenvolvimento gonadal e do sistema nervoso central. A exposição de mulheres grávidas ao BPA é particularmente preocupante para o feto em desenvolvimento, visto que atravessa a placenta passando ao sangue do cordão e ao líquido amniótico Isso é adicionado à pouca ou nula atividade enzimática fetal para biotransformá-lo em BPA-glicuronídeo inativo, o que causa possíveis efeitos nocivos aos descendentes em doses muito baixas e sustentadas. Visando a estudar a exposição ao BPA e seus efeitos na população da Argentina, foi desenvolvido e validado um método analítico por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa, que permitem a quantificação de vestígios de BPA livre (forma estrogênica, livre) em plasma do cordão umbilical. A técnica consiste na precipitação de proteínas do sangue de cordão por adição de acetonitrila e posterior centrifugação e injeção no sobrenadante. Na cromatografia líquida, foi utilizada uma eluição isocrática, e a espectrometria de massa foi realizada utilizando Electrospray negativo em modo de monitoramento de reações múltiplas. Os valores de BPA livre quantificados estão na faixa de 1,0 a 12,1 ng/mL, limite de detecção: 0,6 ng/mL.

Identificação por espectrometria de massa MALDI-TOF de Salmonella spp. e Escherichia coli isolados de carcaças bovinas / MALDI-TOF mass spectrometry identification of Salmonella spp. and Escherichia coli isolated from bovine carcasses

O objetivo deste trabalho foi introduzir a técnica de espectrometria de massa com fonte de ionização e dessorção a laser assistida por matriz e analisador de tempo-de-voo (MALDI-TOF) para incrementar o método tradicional microbiológico na detecção de Salmonella spp. e Escherichia coli em carcaças bovinas. Foram avaliadas 270 amostras de 90 carcaças de bovinos. Para isolamento de Salmonella spp. e E. coli, foram utilizadas, respectivamente, as metodologias descritas na ISO 6579:2002 e no Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. As análises por MALDI-TOF foram realizadas a partir de isolados cultivados em ágar nutriente ou em caldo triptona de soja, provenientes das amostras com características bioquímicas positivas (n=7), inconclusivas (n=4) e negativas (n=85) para Salmonella spp. e bioquímicas positivas (n=37) e negativas (n=85) para E. coli. Os perfis de massas foram adquiridos com o espectrômetro de massas MALDI-TOF Autoflex III SmartBeam e os espectros brutos foram processados usando o programa MALDI Biotyper (Bruker Daltonics). De acordo com a identificação preliminar, com base na morfologia das colônias e nas reações bioquímicas, sete isolados foram considerados positivos para Salmonella spp. Através do MALDI Biotyper, esses sete isolados foram classificados como pertencentes ao gênero Salmonella e, além disso, identificados como S. enterica. Quatro isolados que apresentaram características fenotípicas não usuais e resultados inconclusivos nos testes bioquímicos para Salmonella foram identificados como pertencentes aos gêneros Citrobacter e Proteus após análise por MALDI. Para E. coli, 37 amostras foram positivas pelos testes bioquímicos da espécie, o que foi confirmado por MALDI Biotyper. A metodologia MALDI-TOF permitiu a rápida confirmação da identidade de Salmonella spp. e E. coli, podendo ser utilizada para detecção desses microrganismos em isolados bacterianos de carcaças bovinas.(AU)

The aim of this study was to introduce matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) time-of-flight (TOF) mass spectrometry to improve the traditional microbiological method for the detection of Salmonella spp. and Escherichia coli in beef carcasses. Two hundred seventy samples from 90 beef carcasses were evaluated. The methodologies described in ISO 6579:2002 and in the Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods were used for Salmonella spp. and E. coli isolation, respectively. MALDI-TOF analysis were performed on tryptone soya broth suspension isolates or directly from nutrient agar colonies, from the positive, inconclusive or negative biochemically tested samples for Salmonella and E. coli. Mass profiles were acquired on an Autoflex III SmartBeam MALDI-TOF mass spectrometer and the raw spectra were processed using the MALDI Biotyper software (Bruker Daltonics). According to the preliminary identification based on colony morphology and the biochemical reactions, seven isolates were positive for Salmonella spp. Through MALDI Biotyper these seven isolates were also classified as belonging to the genus Salmonella and further identified as S. enterica. Four isolates showing unusual phenotypic characteristics and inconclusive results in biochemical tests for Salmonella were identified as belonging to Citrobacter and Proteus genera after MALDI analysis. Regarding Escherichia coli, 37 were positive for species biochemical testing which MALDI Biotyper confirmed. MALDI-TOF methodology allowed rapid Salmonella spp. and E. coli identity confirmation and may be used to detect these microrganisms within bacterial isolates from beef carcasses.(AU)

A análise proteômica no contexto forense / The proteomic analysis in the forensic context

Realizou-se uma revisão de literatura consultando as bases de dados Medline, LILACS, BBO e Scielo, de 1997 a 2017, com o objetivo de ressaltar a importância do estudo da proteômica e sua aplicação nas diversas áreas forenses. Conclui-se que a evolução da tecnologia de espectrometria de massa juntamente com os bancos de dados proteômicos aplicados para o estudo das proteínas do corpo humano são de grande importância no contexto forense e podem fornecer subsídios nas diversas áreas da Criminalística, assim como na identificação e diferenciação de fluidos, tecidos e órgãos do corpo humano; na Criminologia no diagnóstico de doenças mentais; na Arqueologia e na Antropologia Forense no estudo da evolução das espécies, na estimativa da ancestralidade, do sexo, da cor dos olhos e cabelo e da idade, auxiliando nos processos de identificação humana.

It was performed a literature review on Medline, LILACS, BBO and Scielo databases from 1997 to 2012 in order to highlight the importance of the study of proteomics and its application in the various forensic areas. It is concluded that the evolution of the technology of mass spectrometry together with the proteomic databases applied to the study of proteins of the human body are of great importance in the forensic context and can provide subsidies in the different areas of Criminalistics as well as in the identification and differentiation of fluids, tissues and organs of the human body; in Criminology in the diagnosis of mental illness; in Archeology and Forensic Anthropology in the study of the evolution of species, in the estimation of ancestry, sex, eye color and hair and age, aiding in the processes of human identification.

Proteomics analysis after traumatic brain injury in rats: the search for potential biomarkers / Análise proteômica após lesão cerebral traumática em ratos: a busca por biomarcadores

Many studies of protein expression after traumatic brain injury (TBI) have identified biomarkers for diagnosing or determining the prognosis of TBI. In this study, we searched for additional protein markers of TBI using a fluid perfusion impact device to model TBI in S-D rats. Two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry were used to identify differentially expressed proteins. After proteomic analysis, we detected 405 and 371 protein spots within a pH range of 3-10 from sham-treated and contused brain cortex, respectively. Eighty protein spots were differentially expressed in the two groups and 20 of these proteins were identified. This study validated the established biomarkers of TBI and identified potential biomarkers that could be examined in future work.

Muitos estudos de expressão proteica após lesão cerebral traumática (LCT) identificam biomarcadores para determinação diagnóstica ou prognóstica do LCT. No presente estudo, foram investigados marcadores proteicos adicionais de LCT, através de um aparelho de impacto no fluxo e perfusão em ratos S-D. Eletroforese bidimensional em gel e espectrometria de massa foram utilizadas para identificar diferentes proteínas expressas. Após a análise proteômica, detectamos marcas de proteínas 405 e 371, com pH variando entre 3-10 no córtex de ratos sham e naqueles com contusão cerebral, respectivamente. Oitenta marcas proteicas foram expressas nos dois grupos e 20 destas proteínas foram identificadas. Este estudo validou o estabelecimento de biomarcadores de LCT e identificou potencial biomarcadores que poderão ser estudados em estudos futuros.

Determination of cortisol and cortisone in human saliva by a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method / Determinação de cortisol e cortisona na saliva por método baseado em cromatografia líquida e espectrometria de massas em tandem

Objective Salivary cortisol measurement plays an important role in the evaluation of adrenal function. Its high correlation with free serum cortisol, the easy of sampling and the limited presence of interfering steroids, generated multiple recent studies of its application, in special in the screening of adrenal hyperfunction. In this paper we present our experience in the development of a high pressure liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) method for salivary cortisol and cortisone measurement. Materials and methods For this study we used 181 saliva samples from our routine diagnostic laboratory. The HPLC-MS/MS method was based on a Waters Quattro Premier tandem mass spectrometer with an electrospray probe. After derivatization with hydroxylamine transitions monitored included cortisol and cortisone. An in-house radioimmunoassay (RIA) was used for salivary cortisol results comparison. Results Functional sensitivity was 24 ng/dL for cortisol and linearity from 24 to 1929 ng/dL. Saliva cortisol values obtained in the 181 samples presented a median of 52 ng/dL with 5‐95% percentile of 24 and 374 ng/dL. With the RIA the results were 86, 25 and 436 ng/dL, respectively, with values for RIA being significantly higher (P<0.0001) and high correlation (r=0.8312, P<0.0001). Cortisone measured in 159 samples showed a median of 278 ng/dL, with 5‐95% percentile of 100 and 1,133 ng/dL. Correlation with cortisol values was significant (r=0.820, P<0.0001). Conclusion We conclude that the HPLC-MS/MS method compares favorably with the RIA for salivary cortisol measurement, with the additional possibility of concomitant cortisone measurement and the evaluation of 11βHSD2 activity. .

Objetivo A dosagem de cortisol salivar é uma metodologia que vem tendo crescente aceitação no estudo da função adrenocortical. Sua alta correlação com a fração livre sérica, facilidade de coleta e presença limitada de interferentes têm originado múltiplas publicações, em especial no screening de pacientes suspeitos de hiperfunção. Neste trabalho apresentamos nossa experiência no desenvolvimento de metodologia baseada em cromatografia líquida e espectrometria de massas (HPLC-MS/MS) para a medida de cortisol e cortisona salivares. Materiais e métodos Para este estudo utilizamos 181 amostras de saliva de nossa rotina diagnóstica. A metodologia de HPLC-MS/MS baseou-se num espectrômetro de massas Waters Quattro Premier. Após derivatização com hidroxilamina, as transições monitoradas incluíram cortisol e cortisona. Um radioimunoensaio (RIE) in house foi empregado para comparação. Resultados A sensibilidade funcional para cortisol foi de 24 ng/dL, com linearidade entre 24 e 1,929 ng/dL. Os valores de cortisol obtidos nas 181 amostras apresentaram mediana de 52 ng/dL, com percentis 5‐95% de 24 e 374 ng/dL. Com o RIE, os resultados foram 86, 25 e 436 ng/L, respectivamente, com os valores obtidos no RIE significativamente mais elevados (P<0,0001), e alta correlação (r=0,8312, P<0,0001). Cortisona, medida em 159 amostras, mostrou mediana de 278 ng/dL, com percentis 5‐95% entre 100 e 1.133 ng/dL. A correlação com os valores de cortisol foi significativa (r=0,820, P<0,0001). Conclusão Concluímos que o método baseado em HPLC-MS/MS compara-se favoravelmente com o RIE para a medida de cortisol salivar, com a possibilidade adicional da medida concomitante de cortisona e avaliação da atividade da enzima 11βHSD2. .

Técnicas analíticas contemporáneas para la identificación de residuos de sulfonamidas, quinolonas y cloranfenicol / Contemporary analytical techniques to identify residues of sulfonamides, quinolones and chloramphenicol / Técnicas analíticas contemporâneas para a identificação de resíduos de sulfonamidas, quinolonas e cloranfenicol

El uso excesivo de fármacos en la industria veterinaria genera bioacumulación en órganos, tejidos, músculos y grasa animal. Dependiendo de la concentración, estos residuos llegan al hombre vía cadena alimentaria. La normatividad para dicha problemática en algunos países, no es suficiente, por eso es fundamental establecer normas estipuladas por la unión europea, sentando bases para su vigilancia y control a nivel nacional. La seguridad alimentaria está relacionada con el uso de fármacos y sus residuos, ejemplo de ellos, son las sulfonamidas, quinolonas y cloranfenicol, que se han encontrado en diferentes animales de abasto. En esta revisión, se incluyen técnicas analíticas empleadas para la identificación de los residuos generados por fármacos, enfatizando en aquellas tecnologías de reciente desarrollo y que son herramientas fundamentales para el control de esta problemática. La cromatografía líquida combinada con la espectrometría de masas y sus diferentes sistemas de interfaces, son las tecnologías más recomendadas para la detección de este tipo de residuos en diferentes matrices alimentarias.

The excessive use of drugs in the veterinary industry generates bioaccumulation in animal organs, tissues, muscles and fat. Depending on the concentration, these residues can reach man via the food chain. Food safety comprehends the use of these drugs and their residues such as sulfonamides, chloramphenicol and quinolones, which have been found in different slaughter animals. Some countries have limited regulations to control this issue. The implementation of standards set by the European Union is essential to monitor and control this problem at a national level. In this review, we use analytical techniques to identify the residues produced by these drugs, focusing on recently developed technologies that are essential tools to control this problem. Liquid chromatography combined with mass spectrometry and its various interface systems is the most recommended technology to detect residues in various food matrices.

O uso excessivo de drogas na indústria veterinária gera bio-acumulação em órgãos, tecidos, músculos e gordura animal. Dependendo da concentração, estes resíduos chegam ao homem através da cadeia alimentar. Os regulamentos para este problema em alguns países não é suficiente, por isso é essencial estabelecer normas estipuladas pela União Europeia, que determina as bases para o monitoramento e controle a nível nacional. A segurança alimentar está relacionada com o uso de fármacos e seus resíduos, por exemplo, sulfonamidas, quinolonas e cloranfenicol os quais foram encontrados em diferentes animais para abate. Nesta revisão, incluem-se técnicas analíticas utilizadas para a identificação dos resíduos gerados pelos fármacos, enfatizando as tecnologias recentemente desenvolvidas as quais são ferramentas essenciais para controlar este problema. Cromatografia líquida combinada com a espectrometria de massa e seus vários sistemas de interfaces são as tecnologias mais recomendadas para a deteção deste tipo de resíduos em diversas matrizes alimentares.

Evaluation of MALDI-TOF MS in the microbiology laboratory / Avaliação da técnica de MALDI-TOF MS no laboratório de microbiologia

Rapid identification of microorganisms by the clinical microbiology laboratory is of crucial importance for optimal patients’ management and treatment. In general, bacterial identification by conventional methods requires 18-24 hours for colony isolation and at least 24 additional hours for species identification. New technologies in microbiology have focused on the rapid diagnosis of bloodstream infections, since they are associated with high morbidity and mortality rates.

A rápida identificação de microrganismos no laboratório de microbiologia clínica é de extrema importância para direcionar o manejo e o tratamento de pacientes. Geralmente, a identificação bacteriana por métodos bioquímicos convencionais necessita de 18 a 24 horas para o crescimento e o isolamento da colônia bacteriana e, pelo menos, 24 horas adicionais para a identificação da espécie. Novas tecnologias em microbiologia têm focado no desenvolvimento de métodos relacionados com o diagnóstico rápido das infecções da corrente sanguínea, uma vez que essas infecções são associadas à alta morbimortalidade.

New methods of microbiological identification using MALDI-TOF / Novas metodologias de identificação de micro-organismos: MALDI-TOF

Rapid diagnosis of pathogens is decisive to guarantee adequate therapy in infections: culture methods are precise and sensitive, but rather slow. New resources are available to enable faster diagnosis, and the most promising is MALDI-TOF technology: mass spectrometry applied to microbiological diagnosis. Times as fast as 10 to 15 minutes to etiological diagnosis are possible after a positive blood culture result. We hope to have this technology in our laboratory, ANVISA permitting and improving their very slow rate of doing things... MALDI-TOF is basically putting a sample of culture or an enriched suspension of the probable pathogen over a small spot with a matrix and vaporizing it with a laser pulse: the products are aspired into a chamber, ionized and reach detectors at variable times: the detectors show time of arrival and quantity of the product, and each pathogen has its characteristic spectrum analyzed by a software.

O diagnóstico rápido de patógenos é crucial para a terapêutica adequada. O método clássico de cultura é preciso e sensível, mas demorado; novos métodos permitem um diagnóstico muito mais rápido, que pode ser tão precoce como 15 minutos após obter um material enriquecido. Em uma hemocultura, por exemplo, é possível saber o agente etiológico nesse prazo, assim que a cultura se mostrar positiva. Esse novo método é o MALDI-TOF, uma aplicação da espectrometria de massa à microbiologia: o material é colocado em uma placa com matriz e bombardeado com um laser que o evapora; um sistema ioniza e aspira o material volatilizado, que chega a detectores, os quais registram o tempo em que a substância chega ao detector e sua quantidade. Cada patógeno tem um espectro característico que é analisado por um software.

Method development and validation for naratriptan determination in human plasma by HPLC with tandem mass spectrometry detection, and its application to bioequivalence study / Desenvolvimento de método e validação para determinação de naratriptan em plasma humano por HPLC com detecção de espectrometria de massa em tandem, e sua aplicação ao estudo de bioequivalência

The authors developed a simple, sensitive and specific liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method for the quantification of naratriptan (NP) in human plasma using naratriptan-d3 (NPD3) as an internal standard (IS). Chromatographic separation was performed on a Zorbax SB-C18, 75 x 4.6 mm, 3.5 µm column with an isocratic mobile phase composed of 0.1 percent formic acid : acetonitrile (50:50 v/v), at a flow-rate of 0.6 mL/min. NP and NPD3 were detected with proton adducts at m/z 336.5→98.0 and 339.4→101.0 in selected reaction monitoring (SRM) positive mode, respectively. The liquid-liquid extraction method was used to extract the NP and NPD3. This method was validated over a linear concentration range of 0.1-25.0 ng/mL with a correlation coefficient of (r2) > 0.9998. The Intra-day and Interday precision was found to be 1.8 to 3.6 percent, and 2.3 to 2.6 percent, and accuracy to be 101.7- 104.2 percent and 101.8 to 102.9 percent, respectively. NP was found to be stable throughout freeze-thaw (three cycles), bench top and auto sampler stability studies. This method was successfully applied for the analysis of plasma samples following oral administration of NP (2.5 mg) in 31 healthy Indian male human volunteers under fasting conditions.

Os autores desenvolveram um método simples, sensível e específico de cromatografia líquida-espectrometria de massa-tandem (LC-MS/MS) para a quantificação de naratriptan (NP) em plasma humano empregando naratriptan-d3 (NPD3) como padrão interno de referência (IS). A separação cromatográfica foi realizada em coluna Zorbax SB-C18, 75 x 4,6 mm, 3,5 μm com fase móvel isocrática composta por 0,1 por cento ácido fórmico : acetronitrila (50:50 v/v) e taxa de fluxo de 0,6 mL/min. NP e NPD3 foram detectados com adutos de prótons a m/z 336.5→98.0 e 339.4→101.0 in em modo positivo do tipo monitoramento de reação selecionada (SRM), respectivamente. Extração líquido-líquido foi empregada para extrair NP e NPD3, sendo o método validado para uma faixa linear de concentração de 0,1-25,0 ng/mL resultando em coeficiente de correlação (r2) > 0,9998. A variação intra e interdia observada para precisão foi de 1,8 a 3,6 por cento e 2,3 a 2,6 por cento, respectivamente; para exatidão a variação foi de 101,7 a 104,2 por cento e 101,8 a 102,9 por cento, respectivamente. O NP se mostrou estável frente a processos de congelamento-descongelamento (3 ciclos), e estudos de estabilidade de bancada e amostragem automática. O método desenvolvido foi aplicado com sucesso para a análise de amostras de plasma após a administração oral de 2,5 mg de NP em 31 voluntários humanos, de nacionalidade indiana, sexo masculino, sob condições aceleradas.

Estudo do metabolismo, quimica e farmacocinetica do principal metabolito da diidroergocristina / Metabolic, chemical and pharmacokinetics of the main diidroergocristine metabolite

Diidroergocristina (DHEC) é um fármaco semi-sintético, derivada do alcalóide do Ergot, principalmente utilizada para enxaqueca e estudada em distúrbios cognitivos relacionados ao envelhecimento. No presente estudo, o seu principal metabólito 8-hidroxidiidroergocristina (8'-OH-DHEC) foi produzido através de incubação de preparações enzimáticas de fígado de boi usando o Mesilato de Diidroergocristina como substrato. Foi feita uma avaliação de qual o melhor método de preparação enzimática a ser utilizado para produção do padrão do metabólito ativo em grande escala através da comparação de atividade enzimática entre microssomos e S12, ambos extraídos de heptócitos de fígado bovino. A purificação desse metabólito foi feita através da utilização de uma coluna cromatográfica clássica com sílica gel e cromatografia líquida de fase reversa. Sua identificação foi baseada em mensuração de sua massa molecular por espectro de fragmentação de massa e Ressonância Magnética (NMR - 1H/13C). Através da produção dessa substância in vitro, um método rápido, sensível e robusto de determinação da DHEC e seu principal metabólito foi desenvolvido e validado em LC-MS/MS a partir de análise de plasma humano. Bromocriptina foi utilizado com padrão interno e os limites de quantificação da DHEC e 8-OH-DHEC foram 10 pg/ml e 20 pg/ml, respectivamente. Os parâmetros farmacocinéticos foram investigados em 12 voluntários masculinos através da administração de uma dose única oral de 18mg...

Dihydroergocristine (DHEC) is a semi-synthetic drug mainly used for migraine and studied in age-related cognitive impairment. In this study, its major metabolite 8´-hydroxy-dihydroergocristine (8´-OH-DHEC) was produced in incubates of a bovine liver preparation using dihydroergocristine mesylate (DHECM) as substrate. An evaluation of the best enzymatic preparation method was done in order to verify the adequate process for massive production of the metabolite. A comparison between microssomes and S12 was performed, where both preparations were extracted from bovine hepatocytes. Purification was achieved by flash silica gel column and reverse phase liquid chromatographies, and identification was based on accurate molecular mass measurements, mass fragmentation spectra and NMR (1H/13C) chemical shifts. By using the substance produced in vitro, a fast, sensitive, specific and robust LC/MS/MS method for the simultaneous determination of DHEC and its major metabolite in human plasma was...

Importância da metodologia na dosagem de testosterona sérica: comparação entre um imunoensaio direto e um método fundamentado em cromatografia líquida de alta performance e espectrometria de massa em tandem (HPLC/MS-MS) / The importance of methodology in serum testosterone measurement: comparison between a direct immunoassay and a method based on high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry (HPLC/MS-MS)

A dosagem de testosterona sérica, total ou fração livre, é metodologia de alto valor diagnóstico e encontra-se disponível na maioria dos laboratórios clínicos. Esta disponibilidade foi possível pelo desenvolvimento de metodologias simples e diretas, adaptáveis a plataformas de dosagem automatizada. Uma série de publicações recentes tem alertado quanto às limitações destas metodologias, em especial em amostras com baixas concentrações, como mulheres e crianças. Neste trabalho serão apresentados os resultados do emprego de uma metodologia de referência, fundamentada em cromatografia líquida de alta performance e espectrometria de massa em tandem (HPLC/MS-MS), e sua comparação com uma dosagem de rotina (ensaio eletroquimioluminescente - ECLIA). Os métodos são comparados tanto na dosagem de testosterona total (n = 213) quanto na determinação de testosterona livre calculada com base na determinação da testosterona total e da proteína carregadora de hormônios sexuais (SHBG) (n = 135). Os valores obtidos com o ECLIA são significativamente mais elevados, sendo a dispersão mais nítida em soros com baixas concentrações. Tal fenômeno fica mais claro quando apresentado na forma de gráficos de Bland-Altman. Neste trabalho são discutidas as dificuldades de implementação de uma metodologia de referência, como a apresentada, e a convivência com as metodologias de rotina, bem como a literatura recente sobre o assunto.

Serum testosterone in its total or free form, is a highly valuable diagnostic test and is available in the great majority of clinical laboratories. This reality was possible due to the development of simple and direct assays, adaptable to large automatic systems. Recent publications have called attention to the limitations of these simplified methodologies, mainly in samples with low concentration, as women and children. In this paper we present results obtained using a reference method based on high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry (HPLC/MS-MS) and its comparison with those obtained with a commercial routine immunoassay (electrochemiluminescent assay, ECLIA). Methods were compared in total testosterone measurement (n = 213), as well as in free testosterone evaluation based on calculation inclu-ding sex hormone-binding protein (SHBG) levels (n = 135). Values obtained with ECLIA were significantly higher, with more marked dispersion in low concentration. This phenomenon is clearer when presented as a Bland-Altman plot. Difficulties in the implementation of reference methods as the one presented are discussed, as well as the necessity of caution in the interpretation of values obtained with routine assays, a matter of several publications in recent literature.