Caracterização da letalidade dos venenos de serpentes Bothrops jararaca e Crotalus durissus terrificus, por meio de ensaio em ovos embrionados de galinha

Em 2017, a Organização Mundial da Saúde voltou a considerar o ofidismo como uma doença tropical negligenciada de maior prioridade. As serpentes do gênero Bothrops têm destaque por serem responsáveis por mais de 90% dos acidentes ocorridos no Brasil. Já o gênero Crotalus apresenta um percentual de 7,7%, com letalidade maior nos acidentes crotálicos (1,87%) (Fundação Nacional de Saúde, 1988). O ensaio em ovos embrionados de galinha (OEG), representa um modelo in vivo, alternativo ao teste convencional em camundongos para teste de letalidade, sendo um método bastante eficaz e versátil para estudos pré-clínicos, podendo também atuar de forma complementar aos testes in vitro. Sendo assim, o presente estudo teve como objetivo analisar, por meio de ensaio em OEG, a determinação da letalidade induzida pelos venenos, obtidos do laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan de Bothrops jararaca e Crotalus durissus terrificus. Foi feita a avaliação da aplicabilidade de doses desafio desses venenos para calcular a dose letal 50% (DL50). Nesta pesquisa, foram utilizados 300 ovos fertilizados de galinhas da linhagem Novogen White, SPF, em embriões de 6 e 7 dias de desenvolvimento. Os OEG foram incubados a 37oC e 62% de umidade relativa até o momento de inoculação. Nos OEG, foram inoculados na cavidade alantoide, os venenos de B. jararaca (VBj) as concentrações de VBj: 84,2 μg a 2,63125 μg/ovo e C. durissus terrificus (VCdt) as concentrações de VCdt: 5,74 μg a 0,179375 μg/ovo, tendo como grupos controles o crescimento de ovos sem qualquer inoculação (GC) e controles inoculados com salina (GS) em paralelo. Os embriões foram analisados por meio de ovoscopia manual, após os tempos de incubação, nos intervalos de 24 horas e 48 horas, para avaliação da função vascular. Foi realizada a inspeção macroscópica das lesões dos embriões mortos e registro fotográfico. Os resultados obtidos de dose letal 50% (DL50) em OEG no teste de VCdt foram de DL50=0,8035 μg/ovo nos embriões de 6 dias e DL50=0,09113 μg/ovo nos embriões de 7 dias de desenvolvimento. Já o teste para VBj os valores estimados de DL50 foram de DL50=21,91 μg/ovos nos embriões de 6 dias e DL50=24,37 μg /ovo em embriões de 7 dias de vida embrionária. Os valores de DL50 obtidos em OEG ao serem comparados com os valores de DL50 em camundongos, demostraram ter boa correspondência entres as metodologias. A partir do uso dessa técnica, verificou-se que os OEG podem ser utilizados como alternativo ao método convencional em camundongos.

Ensino em tempos de pandemia: adaptações a um grande desafio

Prezados leitores, Desde que recebi o convite para ser editora científica da revista Vigilância Sanitária em Debate: Sociedade, Ciência & Tecnologia (Health Surveillance under Debate: Society, Science & Technology) ­ Visa em Debate, tenho direcionado muita atenção para o fortalecimento da revista como potencial veículo de disseminação de conhecimento em Vigilância Sanitária. As áreas de pesquisa e desenvolvimento tecnológico têm caminhado intrinsecamente, porém outras, como a educação e a formação profissional em Vigilância Sanitária, necessitam de muita promoção e projetos que possibilitem essa formação.

Métodos alternativos para determinação da potência de veneno e antiveneno botrópico: aplicações e perspectivas para o controle da qualidade / Alternative methods for potency evaluation for Bothrops venom and antivenom: applications and perspectives for quality control

Introdução: Acidentes com animais peçonhentos são classificados como doenças tropicais negligenciadas e são atualmente a mais frequente causa de intoxicação em humanos no Brasil. O único tratamento disponível é a rápida administração de antivenenos específicos e de qualidade garantida. Para assegurar a eficácia e a segurança desses produtos, são realizados ensaios de determinação da potência in vivo para veneno e antiveneno, desde as etapas de produção até sua liberação final. Apesar dos diversos estudos sobre métodos   alternativos ao ensaio murino, nenhum método foi efetivamente validado. Objetivo: Compilar os métodos alternativos desenvolvidos para os antivenenos botrópicos, avaliando sua disponibilidade, perspectivas e aplicações em laboratórios de produção e controle da qualidade. Método: Foi realizada uma busca nas bases PubMed, BVS e Scopus entre novembro de 2021 e junho de 2022. Foram identificados 89 trabalhos, dos quais 31 foram selecionados de acordo com os critérios de elegibilidade. Resultados: Nos métodos alternativos identificados, observamos a preferência de 42,80% dos estudos por metodologias que utilizem linhagens celulares como método alternativo aos ensaios murinos, sendo que a maioria destes trabalhos 58,30% optou pela linhagem celular Vero. Conclusões: Pela diversidade das toxinas encontradas em cada gênero de serpentes, entende-se que é de extrema importância que o ensaio de potência dos antivenenos tenha como base a avaliação e a quantificação precisa da inibição da atividade biológica dos venenos. Ensaios de citotoxicidade são amplamente utilizados e têm acumulado evidências de sua adequação como importante ferramenta alternativa ao ensaio murino para o controle da qualidade de veneno e antiveneno antibotrópico.

Introduction: Accidents with venomous animals are classified as neglected tropical diseases and are currently the most frequent cause of intoxication in humans in Brazil. The only available treatment is the rapid administration of specific, quality-assured antivenoms. To ensure the efficacy and safety of these products, in vivo potency determination tests for venom and antivenom are performed during the production stages, until final release. Despite several studies on alternative methods to the murine assay, no method has been effectively validated. Objective: To compile alternative methods developed for Bothrops antivenoms, assessing the availability of the methods and the prospects and applications in Bothrops venom and antivenom production and quality control laboratories. Method: A search was conducted in PubMed, BVS, and Scopus databases between November 2021 and June 2022. 89 articles were identified, of which 31 were selected according to the eligibility criteria. Results: We observed in the alternative methods identified a preference of 42.80% of the studies for methodologies that use cell lines as an alternative method to the murine assays, and most of these works (58.30%) opted for a VERO cell line. Conclusions: Due to the diversity of toxins found in each genus of snakes, it is understood that the potency assay for antivenoms should be based on the evaluation and precise quantification of the inhibition of biological activity of venoms. Cytotoxicity assays are widely used and have been accumulating evidence of their suitability as an important alternative tool to the murine assay for quality control for Bothrops venom and antivenom.

Utilização do método alternativo in vitro em substituição ao método in vivo na detecção de pirogênio para produtos injetáveis

Pyrogens are substances capable of inducing mild reactions such as fever or severe systemic reactions that can lead to death. Injectable products need to be free of pyrogens when released by the quality control of the pharmaceutical industries, to meet good manufacturing practices. Currently there are 3 types of tests for pyrogen detection, the Monocyte Activation Test, the Bacterial Endotoxin Test and the Pyrogen Test in Rabbits, which is widely used in the release of injectable products. However, the pyrogen test in rabbits requires the use of many animals and cannot be used in certain substances such as anti-inflammatory drugs. The alternative method of bacterial endotoxin testing is not able to detect other pyrogens such as products of the metabolism of fungi, viruses and gram-positive bacteria. The Monocytes Activation Test is an alternative method that covers a wide range of pyrogens, can be used on a large scale for the release of injectable products and is more sensitive because it uses human blood as substrate. This study aimed to evaluate the applicability of the use of the monocytes activation test in place of the pyrogen test in rabbits used in biological quality control in the release of batches of injectable products produced by the Butantan Institute.

Pirogênios são substâncias capazes de induzir reações leves como febre ou reações sistêmicas severas que podem levar à morte. Os produtos injetáveis necessitam ser livres de pirogênios quando da sua liberação pelo controle de qualidade das indústrias farmacêuticas, para atender as Boas Práticas de Fabricação. Atualmente existem 3 tipos de testes para detecção de pirogênio, o teste de Ativação de Monócitos, o Teste de Endotoxina Bacteriana e o Teste de Pirogênio em Coelhos, sendo esse amplamente empregado na liberação dos produtos injetáveis. Porém, o teste de pirogênio em coelhos é um teste que demanda a utilização de muitos animais e não pode ser usado em determinadas substâncias como antinflamatórios. O método alternativo de teste de endotoxina bacteriana não é capaz de detectar outros pirogênios como os produtos do metabolismo de fungos, vírus e bactérias gram-positivas. Já o teste de Ativação de Monócitos é um método alternativo que abrange uma ampla gama de pirogênios, pode ser usado em grande escala para liberação dos produtos injetáveis e é mais sensível, pois utiliza como substrato sangue humano. Este trabalho teve como objetivo avaliar a aplicabilidade da utilização do teste de ativação de monócitos em substituição ao teste de pirogênio em coelhos empregado no Controle Qualidade Biológico na liberação dos lotes dos produtos injetáveis produzidos pelo Instituto Butantan.

Análise de viabilidade celular em linhagem RPE - 1 para teste de toxicidade do veneno de Bothrops jararaca (Wied - Neuwied, 1824)

Snake envenomation is classified by the WHO as a neglected tropical disease. Since 2019, due to the 138,000 deaths/year, it has become a target of the organization's plan to reduce deaths and disability. In Brazil, Bothrops jararaca is responsible for 86.8% of accidents, being the subject of many studies to better understand the mechanisms of action of its venom. Toxicity testing commonly involves the use of animal models. Created in 1959, the 3 R’s principle aims to reduce, refine and replace the use of animals with alternative methods with equivalent results. Based on this premise, the objective of this work was to evaluate the toxicity of B. jararaca venom in cell culture as an alternative or complement to toxicity tests performed on animals, aiming at a greater alignment with the 3 R’s principle. RPE-1 cells (15.000 cells/well) were treated with B. jararaca venom between 0.1 μg/mL to 200 μg/mL for 24 h, cell viability and IC50 were calculated by MTT colorimetric assay. Five initial trials established optimal venom concentrations between 10 μg/mL and 200 μg/mL. The results indicated a dose-dependent decrease in cell viability, with a significant drop from 50 μg/mL, presenting viability of 70% and decreasing up to 7% at 200 μg/m. The IC50 calculation resulted in 75.20 μg/mL In conclusion, the work showed that the use of cell culture to analyze cell viability through the MTT test represents an effective method for obtaining data on the cytotoxicity of B. jararaca venom, contributing to the development of alternative methods to the use of animals, according to the principle of the 3 R’s.

O envenenamento por serpentes é classificado pela OMS como uma doença tropical negligenciada. Desde 2019, devido às 138.000 mortes/ano, tornou-se alvo do plano da organização para redução de mortes e invalidez. No Brasil, a espécie Bothrops jararaca é responsável por 86,8% dos acidentes, sendo alvo de muitos estudos para melhor compreensão dos mecanismos de ação de seu veneno. Testes de toxicidade comumente envolvem o uso de modelos animais. Criado em 1959, o princípio dos 3 R’s visa reduzir, refinar e substituir o uso de animais por métodos alternativos com resultados equivalentes. Partindo dessa premissa, o objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade do veneno de B. jararaca em cultura celular como alternativa ou complemento aos testes de toxicidade realizados em animais, visando um maior alinhamento com o princípio dos 3 R’s. Células RPE-1 (15.000 células/poço) foram tratadas com veneno de B. jararaca entre 0,1 μg/mL a 200 μg/mL por 24 h, a viabilidade celular e o IC50 foram calculados através do ensaio colorimétrico de MTT. Cinco ensaios iniciais estabeleceram as concentrações ideais do veneno entre 10 μg/mL e 200 μg/mL. Os resultados indicaram uma diminuição dose-dependente de viabilidade celular, com queda significativa a partir de 50 μg/mL, apresentando viabilidade de 70% e decaindo até 7% em 200 μg/m. O cálculo do IC50 resultou em 75,20 μg/mL Em conclusão, o trabalho mostrou que o uso da cultura celular para análise da viabilidade celular através do teste de MTT representa um método eficaz na obtenção de dados sobre citotoxicidade do veneno de B. jararaca, contribuindo para o desenvolvimento de métodos alternativos ao uso de animais, segundo o princípio dos 3 R’s.

Initial survey on the use of animals in scientific research and teaching reveals divided opinion of the Brazilian population / Investigação inicial sobre o uso de animais na pesquisa científica e no ensino revela opinião dividida da população brasileira

ABSTRACT Objective: Specific legislation regulating the use of animals in research in Brazil was introduced in 2008. However, the viewpoint of the Brazilian population regarding the use of animals in research and teaching activities remains largely unknown. Investigation of the public viewpoint on and understanding of the topic is required given the current shifts in the animal ethics scenario in Brazil. The objective of this study was to provide the first insight into the Brazilian population viewpoint on the use of animals in scientific research and teaching activities. Methods: Data collected in a survey involving 2,115 individuals aged 16 years or older and residing in 130 municipalities distributed across the five Brazilian macroregions (North, Northeast, South, Southeast, and Midwest) were analyzed. The margin of error for entire sample was set at 2%, with a 95% confidence interval. Results: This survey revealed that most Brazilian citizens are in favor of the use animals in research, particularly for medical purposes. Different views depending on the nature of research were identified. Approximately 80% of respondents were also in favor of frequent oversight of laboratories and animal facilities. Conclusion: Survey findings indicate that the opinion of the Brazilian population is divided when it comes to the use of animals in scientific research and teaching. Divided opinions expose a limited understanding of the importance of basic sciences and emphasizes the need for improved communication between the scientific community and the general population. Further strategies aimed to promote animal welfare are discussed.

RESUMO Objetivo: A legislação específica que regula o uso de animais em pesquisa no Brasil foi introduzida em 2008. No entanto, a opinião da população brasileira sobre o uso de animais em atividades de pesquisa e ensino ainda é desconhecida. No atual cenário brasileiro em mudança com relação à ética animal, é necessário avaliar as visões e o conhecimento da população sobre o assunto. O objetivo deste destudo foi realizar o primeiro levantamento da opinião da população brasileira sobre o uso de animais em atividades de ensino e pesquisa científica. Métodos: Analisamos os resultados de uma pesquisa com 2.115 indivíduos com 16 anos ou mais de 130 municípios das cinco macrorregiões brasileiras (Norte, Nordeste, Sul, Sudeste e Centro-Oeste). A margem de erro para toda a amostra foi de 2% dentro de um intervalo de confiança de 95%. Resultados: A pesquisa revelou que a maioria da população brasileira era favorável ao uso de animais em pesquisas, principalmente para fins médicos. Diferentes pontos de vista, dependendo da natureza da pesquisa, também foram identificados. Além disso, aproximadamente 80% dos entrevistados eram favoráveis ao monitoramento frequente de laboratórios e instalações de animais. Conclusão: A opinião da população brasileira está dividida com relação ao uso de animais em pesquisa e ensino científicos. Essa divisão expõe um entendimento limitado da importância das ciências básicas e destaca a necessidade de uma melhor comunicação entre a comunidade científica e a população em geral. Outras ações para alcançar as melhorias desejadas no bem-estar animal são discutidas.

The chick embryo chorioallantoic membrane assay as a model for the study of angiogenesis / Ensaio da membrana corioalantóide de embrião de galinha como modelo para o estudo da angiogênese

Angiogenesis is a fundamental physiological process with strong implications in tissue homeostasis. Animal models helping to identify how angiogenesis is regulated are fundamental to answer many biological questions. Chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) assay is one of the most employed methods to study angiogenesis. In this study we applied a scientometric approach to evaluate the employment of CAM assay in published articles. Temporal trends indicated that CAM assay was the preferred method to investigate angiogenesis over time. The publications had a significant number of citations and the impact factor of journals publishing articles is relevant for the scientific community. A total of 52 different research areas have articles published using this particular technique. Oncology is the research field in which CAM assay was mostly used. Accordingly, tumor-derived cell lines were the most frequent sample tested on CAM. We also identified that 73,6% of articles published used only CAM assay to answer questions concerning angiogenesis. We concluded that although the CAM assay is a classical approach, that does not need so much infrastructure and financial support to be performed, it is a well-accepted technique by the scientific community. In addition, this methodology has gain attention in scientific community because no pain is experienced by the chick and they are minor ethical concerns to employ this method. Moreover, this data can help researchers who are unfamiliar with the CAM assay to identify if this particular method is suitable for their research.

A angiogênese é um processo fisiológico fundamental com fortes implicações na homeostase tecidual. Modelos animais que ajudam a entender como a angiogênese é regulada, são fundamentais para responder a muitas questões biológicas. O ensaio de membrana corioalantóide de embrião de galinha (CAM) é um dos métodos mais empregados para estudar a angiogênese. Neste estudo foi aplicada uma abordagem cientométrica para avaliar o emprego do ensaio CAM em artigos científicos já publicados. Tendências temporais indicaram que o ensaio CAM foi o método mais usado para investigar a angiogênese ao longo do tempo. Os artigos científicos que usaram a metodologia CAM foram publicados em periódicos com significativos números de citações e fator de impacto. No total 52 diferentes áreas de conhecimento usaram a técnica CAM, sendo a oncologia o campo o qual produziu maior número de artigos usando essa metodologia. Consequentemente o material biológico mais testado foi as linhagens celulares tumorais. Também foi identificado que 73,6% dos artigos publicados utilizaram apenas o teste CAM para responder questões relacionadas à angiogênese. Pode se concluir que embora o ensaio CAM seja uma abordagem clássica, que não necessita de muita infraestrutura e apoio financeiro para ser realizado, é uma técnica bem aceita pela comunidade científica. Além disso, esta metodologia tem ganhado atenção na comunidade científica porque os animais testados não sofrem dor e por essa razão esse modelo experimental exige mínimas preocupações éticas. Além disso, esses dados podem ajudar os pesquisadores que não estão familiarizados com o ensaio CAM a identificar se esse método específico é adequado para sua pesquisa.

Aplicabilidade de métodos alternativos no monitoramento da qualidade microbiológica da água tratada para diálise / Applicability of alternative methods for the monitoring microbiological quality of treated water for dialysis

A fim de garantir a qualidade final de produtos os laboratórios de análise microbiológica fornecem dados sobre a qualidade dos mesmos em todas as suas etapas de produção. A crescente preocupação com a saúde dos pacientes conduz à busca de métodos que forneçam resultados precisos e rápidos, pois possibilitam que ações corretivas sejam tomadas em tempo real. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o potencial de tecnologia alternativa no monitoramento de endotoxina bacteriana na água tratada para diálise e dialisato e avaliar o potencial da citometria de fluxo na análise de água. Para isso utilizou-se Portable Test System (PTS®) como método alternativo para detecção de endotoxina bacteriana no monitoramento da água tratada para diálise e dialisato, o qual foi validado frente ao método convencional farmacopeico. Paralelamente realizou-se revisão narrativa da literatura a fim de avaliar a aplicabilidade da citometria de fluxo em análises de água. A análise dos diferentes parâmetros de validação para endotoxina bacteriana no método alternativo mostrou que, exceto para a menor diluição analisada, houve linearidade e precisão nos resultados. Por outro lado a concentração de 0,25 UE/mL foi a menor que apresentou exatidão e especificidade. Observou-se ainda, que o limite de detecção foi de 0,125UE/mL e o de quantificação de 0,25 UE/mL, portanto o intervalo foi de 0,25-1,0 UE/mL. Adicionalmente pela análise de resistência pode-se perceber que ao variar analistas não houve diferença significativa. Em relação ao tempo de análise em uma condição de rotina laboratorial com muitas amostras, o PTS® mostrou-se demorado. Ressalta ainda, que seria importante que a legislação vigente determinasse a análise mensal de endotoxinas no dialisato. A revisão da literatura evidencia o potencial da tecnologia de citometria de fluxo, pois a mesma mostrou-se satisfatória quando comparada a metodologias convencionais para análise de água. O trabalho desenvolvido permitiu concluir que o PTS®) mostrou-se adequado para analisar amostras in loco, permitindo análises em tempo real, que para as quais haja a expectativa de ausência de endotoxinas ou de concentração respeitando o intervalo de 0,25 UE/mL a 1,0 UE/mL. Quanto a citometria de fluxo, esta mostrou-se uma tecnologia promissora em analisar amostras de água, sendo portanto recomendável proceder a estudos de validação e aplicabilidade

In order to guarantee the final quality of products, the microbiological analysis laboratories provide data about their quality at all production stages. The growing concern for patients' health leads to the search for methods that provide accurate and fast results, as they enable corrective actions to be taken in real time. The present work aimed to evaluate the alternative technology potential in the monitoring of bacterial endotoxin in treated water for dialysis and dialysate and to evaluate the potential of flow cytometry in water analysis. The different validation parameters analysis for bacterial endotoxin in alternative method showed that, except for the lowest dilution analyzed, there was linearity and precision in the results. On the other hand, the concentration of 0.25 EU / mL was the lowest that presented accuracy and specificity. It was further observed that the detection limit was 0.125UE / mL and the quantification limit was 0.25 EU / mL, so the range was 0.25-1.0 EU / mL. Additionally by the ruggedness analysis it was possible to perceived that when varying analysts there was no significant difference. Regarding the analysis time in a laboratory routine condition with many samples, the PTS® was was time consuming. It was also observed that it would be important to determine monthly analysis of endotoxins in dialysate. The literature review evidence the flow cytometry technology potential of the because it was satisfactory when compared to conventional methodologies for water analysis. The research showed that the PTS® was suitable for analyzing samples in loco, allowing real-time analyzes, for which there is expectation of endotoxins absence or concentration respecting the range of 0.25 EU / mL to 1.0 EU / mL. For the flow cytometry, it was shown to be a promising technology for analyzing water samples, and it is therefore advisable to carry out validation and applicability studies

Métodos alternativos como parte de las nuevas tendencias en el control de calidad de vacunas / Alternative methods as part of the new trends in vaccine quality control

El control de calidad de las vacunas resulta fundamental para las actividades de producción, liberación lote a lote y comercialización de las vacunas. Sin embargo, en la actualidad este es un proceso que por su concepción es lento y costoso debido a que se apoya en la realización de extensas pruebas en animales para demostrar la potencia y seguridad de estos productos biológicos. El desarrollo de métodos alternativos inspirados en el principio de las 3Rs (Reducción, Refinamiento y Reemplazo) constituye una tendencia que debe impactar de manera muy significativa en la reducción de los tiempos de liberación y el costo del proceso de control de calidad de vacunas en los próximos años. En particular la sustitución de las pruebas de potencia y toxicidad in vivo por procedimientos alternativos más relevantes, rápidos, exactos, reproducibles, robustos y baratos, que incluyen la serología, la cuantificación directa de antígeno, los ensayos en cultivos celulares y el enfoque a consistencia, por solo mencionar algunos; implica un cambio de paradigma, con indiscutibles repercusiones éticas, logísticas, económicas y científico-técnicas, para el aseguramiento de los parámetros de calidad de los inmunobiológicos con el mejor balance costo-beneficio: las vacunas. Los fundamentos técnicos de estos métodos alternativos, sus ventajas y nivel de implementación a nivel internacional, así como sus principales limitaciones, son abordados en este trabajo(AU)

Vaccine quality control is crucial for the manufacturing, lot release and commercialization activities worldwide. However, the current process is by-design too slow and expensive because is based on large animal assays for assuring the potency and safety of these important biological products. The development of 3Rs alternative methods (Reduction, Refinement and Replacement) is a trend able to significantly reduce the releasing times and costs of the vaccine quality control processes in the next few years. Particularly, the replacement of the animals-based potency and toxicity assays by alternative procedures more relevant, fast, accurate, reproducible and cheap, including serology, direct antigen quantification, cell culture tests and the Consistency Approach, for just mentioning some of them, implies a paradigm shift, with undisputable ethical, logistical, economic, scientific and technical repercussions for ensuring the vaccine quality parameters. Theoretical basements, advantages and implementation levels of the alternatives methods as well as their main limitations are presented in this paper(AU)

Métodos alternativos para a detecção de pirogênios em produtos e ambientes sujeitos a Vigilância Sanitária: avanços e perspectivas no Brasil a partir do reconhecimento internacional do Teste de Ativação de Monócitos / Alternative methods for the detection of pyrogens in products and environment subject to public health surveillance: advances and perspectives in Brazil based on the international recognition of the Monocyte Activation Test

Introduction: The detection of pyrogens is essential for the quality control of injectable products. The Rabbit Pyrogen Test remains widely used, despite the existence of alternative methods such as the Monocyte Activation Test (MAT). Objective: To review the use of alternative methods for pyrogen testing, pointing out advances and perspectives from the recognition of MAT by the European pharmacopoeia and its acceptance for regulatory purposes in Brazil. Method: A search was performed on the PubMed and BVS databases, with further classification, categorization by topic and critical analysis of the results. Results: Twenty-four papers were identified, addressing topics such as applications of MAT, its validation and comparisons with in vivo tests. MAT presented better results when compared to other tests, both in the evaluation of biological products and in the detection of non-endotoxin pyrogens. Limitations to diffusion include difficulties in obtaining whole human blood as a source of monocytes, for which several alternatives have been proposed. Conclusions: MAT is a promising method, with application in safety evaluation of new technologies. Its application in Brazil depends on a national implementation policy, which might include greater integration between BraCVAM, Concea and RENAMA in search for its recognition for regulatory purposes.

Introdução: A detecção de pirogênios é imprescindível no controle da qualidade de produtos injetáveis. O Teste de Pirogênio em coelhos ainda tem larga aplicação, apesar da existência de métodos alternativos como o Teste de Ativação de Monócitos (MAT). Objetivo: Revisar o uso dos métodos alternativos no teste de pirogênio, apontando avanços e perspectivas a partir do reconhecimento do MAT pela Farmacopeia Europeia e sua aceitação para fins regulatórios no Brasil. Método: Uma busca foi realizada nas bases PubMed e BVS, com posterior classificação, categorização por assuntos e análise crítica dos resultados. Resultados: Foram identificados 24 trabalhos, abordando temas como as aplicações do MAT, sua validação e comparação com testes in vivo. O MAT apresentou melhores resultados quando comparado a outros testes, tanto na avaliação de produtos biológicos como na detecção de pirogênios não-endotoxinas. Limitações para sua difusão incluem a dificuldade de obtenção de sangue total humano como fonte de monócitos, para o qual diversas alternativas têm sido propostas. Conclusões: O MAT se mostra um método promissor, com aplicação na avaliação da segurança de novas tecnologias. Sua aplicação no Brasil depende de uma política nacional de implantação, que inclua maior Integração entre BraCVAM, Concea e RENAMA na busca por seu reconhecimento para fins regulatórios.

Desenvolvimento de pele humana reconstruída contendo equivalente dérmico glicado na avaliação da eficácia e toxicidade de compostos anti-glicação / Development of reconstructed human skin containing glycated dermal equivalent to toxicity and efficacy tests of anti-glycation compounds

A glicação não enzimática das proteínas é um fator comum para a fisiopatologia de uma série de transtornos relacionados ao envelhecimento e a doenças como o diabetes mellitus (DM). O geração dos produtos de glicação, os AGEs (do inglês: Advanced Glycation End Products) se dá através de reações de glicação da mariz extracelular (MEC) na derme e têm sido apontado como um dos fatores responsáveis pela perda de elasticidade e deficiência de cicatrização da pele. A permeação cutânea de compostos anti-AGE é uma limitação importante para eficiência terapêutica de compostos que devem atingir camadas mais profundas da pele. Modelos de pele reconstruída contendo equivalente dérmico glicado são estruturas tridimensionais geradas in vitro que mimetizam a pele humana e representam um eficiente modelo para o estudo de células e modificações provocadas na MEC no processo de envelhecimento e DM. O modelo 3D de pele reconstruída tem características metabólicas, de permeabilidade e atividade semelhantes à da pele original, potencializando seu papel nas investigações sobre permeabilidade de drogas, toxicidade, irritação, eficácia e segurança de compostos e diferenciação de queratinócitos. Uma série de compostos naturais ou sintéticos inibidores de AGEs têm sido descobertos e apresentados recentemente e podem representar inovação terapêutica no tratamento de modificações causadas pela a formação e acúmulo destes AGEs também na pele. Este estudo avaliou o desenvolvimento da pele reconstruída glicada e posteriormente, a avaliação da eficácia e toxicidade de compostos anti-glicação como aminoguanidina e carnosina em modelo de pele reconstruída glicada. Em perspectiva, este estudo contribuiu para o desenvolvimento de uma nova tecnologia in vitro, a pele reconstruída glicada, que auxiliará a compreensão da biologia da interação célula-MEC mimetizando processos fisiopatológicos importantes como o envelhecimento e o DM

The Advanced Glycation End Products (AGEs) of proteins is a common factor to the pathophysiology of a number of disorders related to aging and diseases such as diabetes mellitus (DM). The generation of the AGEs products on skin occurs mainly through non-enzymatic glycation reactions of the dermal extracellular matrix and has been touted as one of the factors responsible for loss of elasticity and disability of skin healing. The skin permeation of compounds is an important limitation for therapeutic/cosmetic efficacy of anti-AGE compounds, which must reach the deepest layers of the skin. Reconstructed skin model containing dermal equivalent modified by in vitro glycation is able to mimic the elderly human skin and represent an efficient model for the study of cells interactions and changes in extracellular matrix induced by aging and diabetes. The 3D reconstructed skin model has metabolic characteristics, permeability and activity similar to the original skin, reinforcing its role in drug permeability of investigations toxicity, irritation, safety and efficacy evaluation of compounds and differentiation of keratinocytes. A number of natural or synthetic AGEs inhibitor compounds have been recently discovered and displayed and can represent therapeutic innovation for the treatment of changes caused by the aging of the skin. In this study we performed the development of reconstructed glycated skin model and evaluated the efficacy and toxicity of anti-glycation compounds such as aminoguanidine and carnosine. In perspective, this study has contributed to the development of a new technology in vitro, and for the understanding cell-extracellular matrix interaction during the aging of skin

Efeito anticoccidiano de extrato hidroalcoólico de Artemisia annua em camas de aves contaminadas com Eimeria sp / Anticoccidial effect of Artemisia annua hydroalcoholic extract in poultry beds contaminated with Eimeria sp

O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia do extrato hidroalcoólico de Artemisia annua frente a oocistos de Eimeria sp. em camas contaminadas. O extrato foi produzido com 7 dias de percolação a 4°C, sendo posteriormente realizada a marcha fitoquímica; dosagem de fenóis totais, quantificação de artemisinina, ensaio antioxidante e teste de toxicidade. Para testar a atividade anticoccidiana, camas de aves compostas de cepilho de árvores foram contaminadas com 5000 oocistos. Foram formados quatro tratamentos, em triplicata, nos quais foram usadas diferentes concentrações, sendo G1: 12mg/mL, G2: 8mg/mL, G3: 4mg/mL e C-: água. Após a contaminação, foram aspergidos, 800 mL dos extratos nas diferentes concentrações sobre as camas e coletadas, em triplicatas, 10 cm2 de cada local, aleatoriamente, nos tempos: 0, 3, 6, 24, 48, e 72 horas após a aplicação. Nas análises fitoquímicas, foram evidenciados diversos compostos com propriedades antiparasitárias, como flavonoides e taninos. O fitoterápico continha 59,409±1,47μg/dL de artemisinina. O produto na concentração de 12mg.mL-1 apresentou eficácia entre 45,5 e 42,1%. Os resultados dos testes bioquímicos, juntamente com os encontrados no teste anticoccidiano, evidenciaram que o extrato produzido possui alto potencial para combater Eimeria sp.

The aim of this study was to determine the efficacy of hydroalcoholic extract of Artemisia annua against oocysts of Eimeria sp. in contaminated poultry beds. The extract was produced after 7 days of storage at 4°C, which was used to perform the phytochemical screening; the artemisinin measurement; the total phenolic; antioxidant testing and toxicity test. To test the anticoccidial activity, the birds space composed of shaver trees, were contaminated with 5000 oocysts. Four treatment were formed, in triplicate, were used in different concentrations as G1: 12mg/mL, G2:= 9mg/mL, G3: 6mg/mL, and C-: water. After contamination 800 mL of the herbal at different concentrations were sprayed on the bed and collected, in triplicate, 10 cm2 each site, randomly, at times: 0, 3, 6, 24, 48, and 72 hours after application. In phytochemical analysis, were shown compounds with antiparasitic properties, such as flavonoids and tannins. The herbal contained 59.409±1.47mg/dL artemisinin. The product at a concentration of 12mg.mL-1 showed efficacy from 44.25 to 40.71%. The results of biochemical tests, with the in vitro test showed that the extract has produced high potential for combating Eimeria sp.

Efeito anticoccidiano de extrato hidroalcoólico de Artemisia annua em camas de aves contaminadas com Eimeria sp / Anticoccidial effect of Artemisia annua hydroalcoholic extract in poultry beds contaminated with Eimeria sp

O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia do extrato hidroalcoólico de Artemisia annua frente a oocistos de Eimeria sp. em camas contaminadas. O extrato foi produzido com 7 dias de percolação a 4°C, sendo posteriormente realizada a marcha fitoquímica; dosagem de fenóis totais, quantificação de artemisinina, ensaio antioxidante e teste de toxicidade. Para testar a atividade anticoccidiana, camas de aves compostas de cepilho de árvores foram contaminadas com 5000 oocistos. Foram formados quatro tratamentos, em triplicata, nos quais foram usadas diferentes concentrações, sendo G1: 12mg/mL, G2: 8mg/mL, G3: 4mg/mL e C-: água. Após a contaminação, foram aspergidos, 800 mL dos extratos nas diferentes concentrações sobre as camas e coletadas, em triplicatas, 10 cm2 de cada local, aleatoriamente, nos tempos: 0, 3, 6, 24, 48, e 72 horas após a aplicação. Nas análises fitoquímicas, foram evidenciados diversos compostos com propriedades antiparasitárias, como flavonoides e taninos. O fitoterápico continha 59,409±1,47μg/dL de artemisinina. O produto na concentração de 12mg.mL-1 apresentou eficácia entre 45,5 e 42,1%. Os resultados dos testes bioquímicos, juntamente com os encontrados no teste anticoccidiano, evidenciaram que o extrato produzido possui alto potencial para combater Eimeria sp...

The aim of this study was to determine the efficacy of hydroalcoholic extract of Artemisia annua against oocysts of Eimeria sp. in contaminated poultry beds. The extract was produced after 7 days of storage at 4°C, which was used to perform the phytochemical screening; the artemisinin measurement; the total phenolic; antioxidant testing and toxicity test. To test the anticoccidial activity, the birds space composed of shaver trees, were contaminated with 5000 oocysts. Four treatment were formed, in triplicate, were used in different concentrations as G1: 12mg/mL, G2:= 9mg/mL, G3: 6mg/mL, and C-: water. After contamination 800 mL of the herbal at different concentrations were sprayed on the bed and collected, in triplicate, 10 cm2 each site, randomly, at times: 0, 3, 6, 24, 48, and 72 hours after application. In phytochemical analysis, were shown compounds with antiparasitic properties, such as flavonoids and tannins. The herbal contained 59.409±1.47mg/dL artemisinin. The product at a concentration of 12mg.mL-1 showed efficacy from 44.25 to 40.71%. The results of biochemical tests, with the in vitro test showed that the extract has produced high potential for combating Eimeria sp...

Alternative methods in toxicity testing: the current approach

Alternative methods are being developed to reduce, refine, and replace (3Rs) animals used in experiments, aimed at protecting animal welfare. The present study reports alternative tests which are based on the principles of the 3Rs and the efforts made to validate these tests. In Europe, several methodologies have already been implemented, such as tests of irritability, cell viability, and phototoxicity as well as in vitro mathematical models together with the use of in silico tools. This is a complex process that spans from development to regulatory approval and subsequent adoption by various official entities. Within this regulatory framework is REACH, the European Community Regulation for chemicals and their safe use. In Brazil, the BraCVAM (Brazilian Center for the Validation of Alternative Methods) was recently established to validate alternative methods and stimulate incorporation of new methodologies. A new vision of toxicology is emerging for the 21st century (Tox-21), and the subsequent changes are shaping a new paradigm.

Métodos alternativos estão sendo desenvolvidos para a redução, o refinamento e a substituição (3R) do número de animais utilizados em experimentos, visando ao seu bem-estar. Esses testes alternativos baseiam-se no princípio dos 3R e esforços têm sido empregados para que sejam validados. Na Europa, diversas metodologias já foram implantadas tais como: testes de irritabilidade, testes de viabilidade celular, testes de fototoxicidade e modelos matemáticos in vitro, além do uso de ferramentas in silico. Esse é um processo complexo, que abrange desde o seu desenvolvimento até a aceitação regulatória e posterior adoção por diversas organizações oficiais. No contexto regulatório está o REACH, o Regulamento da Comunidade Européia, para produtos químicos e sua utilização segura. No Brasil, o BraCVAM (Centro Brasileiro de Validação de Métodos Alternativos) foi recentemente estabelecido para validação de métodos alternativos e estímulo à incorporação de novas metodologias. Uma nova visão de toxicologia vem surgindo para o século XXI (Tox-21) e as mudanças ocasionadas promoverão um novo paradigma.

Validación de métodos alternativos para análisis microbiológico de alimentos y aguas / Validation of alternative methods for the microbiological analysis of food products and water

El empleo de métodos microbiológicos alternativos para la detección de microorganismos es una herramienta importante para garantizar la inocuidad de alimentos y aguas. Numerosos y diversos métodos alternativos para microbiología se comercializan actualmente gracias a avances recientes, sobre todo en el campo de la biotecnología. Para que un nuevo método microbiológico sea aceptado, su fabricante debe demostrar su adecuación. En una primera revisión, se realizó el análisis de los principales parámetros determinados en la validación de los métodos microbiológicos cualitativos. El objetivo de esta segunda parte consiste en abordar los indicadores más importantes a considerar para los métodos microbiológicos cuantitativos

The use of alternative microbiological methods for the detection of microorganisms is an important tool to ensure the safety of food products and water. A large number of alternative microbiological methods are currently available on the market, thanks to recent advances mainly in the field of biotechnology. In order for a new microbiological method to be accepted, its manufacturer must prove its adequacy. In a first review, an analysis was made of the main parameters determined for the validation of qualitative microbiological methods. The purpose of this second part is to approach the most important indicators to be considered for quantitative microbiological methods

Validación de métodos alternativos para análisis microbiológico de alimentos y aguas / Validation of alternative methods for the microbiological analysis of food products and water

El empleo de métodos microbiológicos alternativos para la detección de microorganismos es una herramienta importante para garantizar la inocuidad de alimentos y aguas. Numerosos y diversos métodos alternativos para microbiología se comercializan actualmente gracias a avances recientes, sobre todo en el campo de la biotecnología. Para que un nuevo método microbiológico sea aceptado, su fabricante debe demostrar su adecuación. En una primera revisión, se realizó el análisis de los principales parámetros determinados en la validación de los métodos microbiológicos cualitativos. El objetivo de esta segunda parte consiste en abordar los indicadores más importantes a considerar para los métodos microbiológicos cuantitativos(AU)

The use of alternative microbiological methods for the detection of microorganisms is an important tool to ensure the safety of food products and water. A large number of alternative microbiological methods are currently available on the market, thanks to recent advances mainly in the field of biotechnology. In order for a new microbiological method to be accepted, its manufacturer must prove its adequacy. In a first review, an analysis was made of the main parameters determined for the validation of qualitative microbiological methods. The purpose of this second part is to approach the most important indicators to be considered for quantitative microbiological methods(AU)

Estudo da segurança de cosméticos: presente e futuro / Study of the safety of cosmetics: present and future

Cosméticos são usados pelo homem desde a antiguidade e, atualmente, o consumo tem aumentado muito, inclusive no Brasil, o terceiro maior mercado no mundo. Assim sendo, a preocupação com a segurança e eficácia destes produtos deve ser intensificada, mesmo sendo produtos raramente relacionados a reações adversas que causem danos à saúde. Para a avaliação das possíveis reações que podem ser apresentadas pelos produtos (irritação, sensibilização, efeitos sistêmicos), a Legislação Brasileira exige que os fabricantes avaliem a segurança e eficácia de seus produtos. Para este fim, em geral, são utilizados animais como modelo experimental o que está sendo cada vez mais evitado, acarretando a pesquisa por métodos alternativos para estas avaliações, que não necessitem de modelos experimentais in vivo. Desta forma, a presente revisão tem por objetivo apresentar os principais ensaios biológicos utilizados para avaliação da segurança de cosméticos, bem como ensaios in vitro que os substituam.

Cosmetics have been used since ancient times and, recently, their consumption has increased greatly in many countries, including brazil, which is the third largest consumer market in the world. Thus, concern for the safety and efficacy of these products should be heightened, even though these products are rarely related to adverse reactions that damage the health. Brazilian law requires manufacturers to subject their products to safety testing, to assess the possible reactions that could be caused by them (irritation, sensitization, systemic effects). To this end, in general, animals have been used as the experimental model, but this practice is being increasingly controlled, so that the scientific community is looking for alternative tests that do not require experimental in vivo models. Thus, this review aims to describe the main biological assays used to assess the safety of cosmetics, as well as in vitro assays that can replace them.

Ensaios da membrana cório-alantoide (HET-CAM e CAM-TBS): alternativas para a avaliação toxicológica de produtos com baixo potencial de irritação ocular / Chorioallantoic membrane assays (HET-CAM and CAM-TBS): alternative tests for performing toxicological evaluation of productswith low potential for ocular irritation

O presente estudo analisou o potencial preditivo de dois modelos que utilizam a membrana cório-alantoidede ovo embrionado de galinha (i.e. o HET-CAM e sua versão modificada, o CAM-TBS, que quantifica os danos à membrana por meio da absorção do corante azul trypan), como estratégia para a implementação de alternativas aos testes in vivo de avaliação de toxicidade ocular. Vinte colírios foram avaliados in vivo por meio do teste de irritação ocular de Draize e por ensaios in vitro utilizando-se testes HET-CAM eCAM-TBS. Todos os colírios foram classificados como não irritantes pelo teste in vivo. No ensaio HETCAM, foram observados 4 resultados falso-positivos, e o teste apresentou especificidade e precisão de 80%. O CAM-TBS demonstrou melhor desempenho, pois a especificidade e a precisão foram de 100%. O ponto de corte adotado (cut-off = 0,9) no HET-CAM é discutido, uma vez que os resultados falso-positivos observados no presente estudo poderiam ter sido contornados caso a categoria “não irritante” englobasse produtos “não irritantes” e “irritantes leves”, à semelhança do critério preconizado para o CAM-TBS (cutoff= 7,0).

Validación de métodos alternativos para análisis microbiológico de alimentos y aguas. cualitativos / Validation of alternative methods for microbiological analysis of foods and water. Qualitative methods

Internacionalmente han aumentado las exigencias para la adopción de nuevos métodos microbiológicos para el análisis de aguas y alimentos. Estos son adoptados cuando ofrecen rapidez, menor laboriosidad, son más sencillos, entre otras ventajas. Para lograr este objetivo, es necesario demostrar su fiabilidad y la equivalencia en relación con los métodos tradicionales existentes. En Cuba esta temática es relativamente incipiente, por lo tanto, resulta oportuno realizar una revisión bibliográfica sobre esta materia. El objetivo de esta primera revisión consiste en abordar los parámetros más significativos relacionados con la validación de métodos microbiológicos cualitativos alternativos.

Internationally the demands for the adoption of new microbiological methods for the analysis of waters and foods have increased. These are adopted when they are high-speed, less laborious, more easy, among other advantages. To achieve this objective, it is necessary to demonstrate their reliability and the equivalence according to the existent traditional methods. In Cuba this topic is relatively incipient, therefore it is appropriate to carry out a review on this matter. The objective of this first revision consists on approaching the more significant parameters related with the validation of alternative qualitative microbiological methods.

Validación de métodos alternativos para análisis microbiológico de alimentos y aguas: métodos cualitativos / Validation of alternative methods for microbiological analysis of foods and water: qualitative methods

Internacionalmente han aumentado las exigencias para la adopción de nuevos métodos microbiológicos para el análisis de aguas y alimentos. Estos son adoptados cuando ofrecen rapidez, menor laboriosidad, son más sencillos, entre otras ventajas. Para lograr este objetivo, es necesario demostrar su fiabilidad y la equivalencia en relación con los métodos tradicionales existentes. En Cuba esta temática es relativamente incipiente, por lo tanto, resulta oportuno realizar una revisión bibliográfica sobre esta materia. El objetivo de esta primera revisión consiste en abordar los parámetros más significativos relacionados con la validación de métodos microbiológicos cualitativos alternativos(AU)

Internationally the demands for the adoption of new microbiological methods for the analysis of waters and foods have increased. These are adopted when they are high-speed, less laborious, more easy, among other advantages. To achieve this objective, it is necessary to demonstrate their reliability and the equivalence according to the existent traditional methods. In Cuba this topic is relatively incipient, therefore it is appropriate to carry out a review on this matter. The objective of this first revision consists on approaching the more significant parameters related with the validation of alternative qualitative microbiological methods(AU)