The waveless model: clinical and research applications of follicular wave suppression in cattle / Modelo waveless: aplicações clínicas e na pesquisa da supressão das ondas foliculares em bovinos

The follicular growth waves are directly linked to the fluctuations in plasma gonadotrophins, which are controlled by the hypothalamic GnRH release pattern. Therefore, if the actions of the GnRH are inhibited or blocked, the final stages of the antral follicle growth are suppressed, resulting in an induced anestrus (a.k.a. waveless model). In the human medicine, GnRH agonists or antagonists are broadly used in the control of ovarian disfunctions, as well as in the preparation of women for assisted reproductive cycles. In cattle, a similar effect can be obtained by active immunization against GnRH. This was shown to be a viable strategy, for example, for the control of chronic cases of cystic ovarian disease in oocyte donors. However, on shall take into account the substantial individual variation on the immune response and, consequently, the lack of control of the duration of the anestrus induced. The waveless model is also very useful as a research model, once it controls the potential interference of the endogenous FSH and LH, improving the sensitivity of essays with exogenous hormones and consequently reducing the required number of replicas within studies.(AU)

O padrão de crescimento folicular em ondas está diretamente associado às flutuações nas concentrações plasmáticas de gonadotrofinas, controladas por sua vez pelo padrão de liberação de GnRH hipotalâmico. Desta forma, a inibição ou bloqueio da ação do GnRH suprime as etapas finais do crescimento folicular, resultando em anestro induzido (também chamado modelo waveless). Na medicina humana, agonistas ou antagonistas de GnRH são utilizados tanto no controle de disfunções ovarianas quanto na preparação de pacientes para procedimentos de reprodução assistida. Em bovinos, este efeito pode ser obtido pela imunização ativa contra GnRH, e mostrou-se estratégia viável, por exemplo, no controle de casos crônicos de doença ovariana cística em doadoras de oócitos. Contudo, é importante considerar a grande variação individual na resposta à imunização e consequente impossibilidade de controlar a duração do anestro induzido. O modelo waveless também é de grande utilidade na pesquisa, uma vez que elimina a potencial interferência do FSH e LH endógenos, aumentando a sensibilidade nos ensaios com hormônios exógenos e consequentemente reduzindo o número de réplicas necessárias nos estudos.(AU)

Asynchrony between in vivo and in vitro rabbit embryos

Background: Comparative features of embryos developed under in vitro and in vivo conditions are particularly important in designing embryo transfer procedures that fulfil embryo-recipient synchronization requirements. Objective: To determine the degree of asynchrony in rabbit embryo development between cultured and in vivo embryos. Methods: A total of 55 non- lactating multiparous female rabbits were used. Embryos were classified as 16-cells or early morulae at 48 hours post-coitum (hpc). Embryos were cultured during 30 or 32 h and embryo development was compared with in vivo embryos of 72 hpc. In vitro and in vivo embryos at 72 hpc were classified as early or compacted morulae. Bayesian statistics was used. Difference between in vivo and in vitro embryos and the actual probability of the difference between the in vivo and in vitro embryo higher than zero (P) was estimated. Results: The percentage of compacted morulae was higher in in vivo embryos than in in vitro embryos with +6 h of asynchrony (73.5 and 32.8%, P=1.00). But the percentage of compacted morulae was similar with +8 h asynchrony. Conclusions: In vitro embryos delay their development by + 8 hours compared to in vivo embryos.

Antecedentes: El desarrollo comparativo de embriones producidos in vitro e in vivo es particularmente importante para el diseño de procedimientos de transferencia de embriones cuando se requiere sincronización entre el embrión y la hembra receptora. Objetivo: Determinar el grado de asincronía en el desarrollo embrionario entre embriones in vivo y cultivados. Métodos: Un total de 55 conejas multiparas no lactantes fueron utilizadas. Los embriones se clasificaron en 16 células o mórulas tempranas a las 48 horas después del coito (hpc). Los embriones se cultivaron durante 30 ó 32 horas y el desarrollo embrionario se comparó con embriones de 72 hpc obtenidos in vivo. Los embriones in vitro e in vivo a 72 hpc se clasificaron como mórulas tempranas o compactas. Se utilizó estadística bayesiana. Se estimó la diferencia entre embriones in vivo e in vitro y la probabilidad de que la diferencia sea superior a cero (P). Resultados: El porcentaje de mórulas compactas fue mayor en embriones in vivo que en embriones in vitro con +6 horas de asincronía (73,5 y 32,8%, P=1,00), pero el porcentaje de mórulas compactas fue similar con asincronía de +8 horas. Conclusión: Los embriones cultivados retrasan +8 horas su desarrollo en comparación con los embriones in vivo.

Antecedentes: A aquisição do desenvolvimento de embriões produzidos in vitro e in vivo é particularmente importante na concepção de procedimentos de transferência de embriões em que a sincronização entre o embrião e a fêmea receptora é necessária. Objetivo: Determinar o grau de assincronia no desenvolvimento embrionário entre embriões cultivados e in vivo. Métodos: Um total de 55 coelhos multíparos não lactantes foram usados. Os embriões foram classificados em 16 células ou mórulas iniciais 48 horas de gestação (hpc). Os embriões foram cultivados por 30 ou 32 horas e o desenvolvimento embrionário foi comparado com embriões de 72 hpc obtidos in vivo. Embriões in vitro e in vivo a 72 hpc foram classificados como mórulas precoces ou compactadas. Estatísticas bayesianas foram usadas. A diferença entre embriões in vivo e in vitro e a probabilidade de que a diferença seja maior que zero (P) foi estimada. Resultados: A porcentagem de mórulas compactadas foi maior em embriões in vivo do que em embriões in vitro com +6 horas de assincronia (73,5 e 32,8%, P=1,00). Mas a porcentagem de mórulas compactadas foi semelhante com assincronia de +8 horas. Conclusão: Embriões cultivados atrasam seu desenvolvimento em +8 horas em comparação com embriões in vivo.

In-vitro production and pre-validation of lyophilized canine platelet-rich plasma for therapeutic use / Produção e validação de plasma rico em plaquetas canino liofilizado para fins de utilização terapêutica

Platelet-rich plasma (PRP) has been considered a promising therapeutic alternative, since platelets are rich in growth factors that are used in the Regenerative Medicine field. However, fresh PRP cannot be stored for long periods. This study aimed to develop a protocol for obtaining lyophilized canine PRP capable of maintaining viability after its reconstitution. For that purpose, canine PRP extraction and lyophilization protocols were initially tested. Subsequently, assays were carried out to quantify the growth factors VEGF and TGF-β, before and after the lyophilization process, gelation test and the three-dimensional gel structure analysis of the reconstituted lyophilized PRP by electron microscopy, as well as in vitro cell proliferation test in lyophilized PRP gel. Additionally, the immunogenicity test was performed, using allogeneic samples of lyophilized PRP. The results showed that the lyophilized PRP had adequate therapeutic concentrations of growth factors VEGF and TGF-β (9.1pg/mL and 6161.6pg/mL, respectively). The reconstituted PRP gel after lyophilization showed an in vitro durability of 10 days. Its electron microscopy structure was similar to that of fresh PRP. In the cell proliferation test, an intense division process was verified in mesenchymal stem cells (MSCs) through the three-dimensional mesh structure of the lyophilized PRP gel. The immunogenicity test showed no evidence of an immune reaction. The findings were promising, suggesting the possibility of having a lyophilized canine PRP that can be marketed. New in vivo and in vitro studies must be carried out for therapeutic confirmation.(AU)

O plasma rico em plaquetas (PRP) é uma alternativa terapêutica promissora, pois as plaquetas são ricas em fatores de crescimento com ação na regeneração de tecidos. No entanto, o PRP fresco não pode ser armazenado por longos períodos. Esse trabalho teve como objetivo desenvolver um protocolo de obtenção de PRP liofilizado canino capaz de manter a viabilidade pós reconstituição. Portanto, foram testados diversos protocolos de extração e liofilização. Para validação do PRP canino liofilizado foi analisada a concentração dos fatores de crescimento VEGF e TGF-β antes e após o processo de liofilização, a estrutura tridimensional do PRP liofilizado reconstituído em forma de gel por microscopia eletrônica e seu efeito in vitro na proliferação de células-tronco mesenquimais. Os resultados demonstraram que o PRP liofilizado apresentou concentrações terapêuticas adequadas dos fatores de crescimento VEGF e TGF- β (9,1pg/ml e 6161,6pg/ml, respectivamente). O gel de PRP reconstituído após liofilização apresentou uma durabilidade in vitro de 10 dias, sua estrutura tridimensional mostrou-se semelhante ao PRP fresco e proporcionou intensa proliferação de células-tronco mesenquimais durante o cultivo. O teste de imunogenicidade não demonstrou evidências de reação imune. Os achados foram promissores, sugerindo a possibilidade de uso de PRP canino liofilizado para o mercado. Novos estudos in vivo e in vitro deverão ser conduzidos para comprovação terapêutica.(AU)

In-vitro production and pre-validation of lyophilized canine platelet-rich plasma for therapeutic use

ABSTRACT: Platelet-rich plasma (PRP) has been considered a promising therapeutic alternative, since platelets are rich in growth factors that are used in the Regenerative Medicine field. However, fresh PRP cannot be stored for long periods. This study aimed to develop a protocol for obtaining lyophilized canine PRP capable of maintaining viability after its reconstitution. For that purpose, canine PRP extraction and lyophilization protocols were initially tested. Subsequently, assays were carried out to quantify the growth factors VEGF and TGF-, before and after the lyophilization process, gelation test and the three-dimensional gel structure analysis of the reconstituted lyophilized PRP by electron microscopy, as well as in vitro cell proliferation test in lyophilized PRP gel. Additionally, the immunogenicity test was performed, using allogeneic samples of lyophilized PRP. The results showed that the lyophilized PRP had adequate therapeutic concentrations of growth factors VEGF and TGF- (9.1pg/mL and 6161.6pg/mL, respectively). The reconstituted PRP gel after lyophilization showed an in vitro durability of 10 days. Its electron microscopy structure was similar to that of fresh PRP. In the cell proliferation test, an intense division process was verified in mesenchymal stem cells (MSCs) through the three-dimensional mesh structure of the lyophilized PRP gel. The immunogenicity test showed no evidence of an immune reaction. The findings were promising, suggesting the possibility of having a lyophilized canine PRP that can be marketed. New in vivo and in vitro studies must be carried out for therapeutic confirmation.

RESUMO: O plasma rico em plaquetas (PRP) é uma alternativa terapêutica promissora, pois as plaquetas são ricas em fatores de crescimento com ação na regeneração de tecidos. No entanto, o PRP fresco não pode ser armazenado por longos períodos. Esse trabalho teve como objetivo desenvolver um protocolo de obtenção de PRP liofilizado canino capaz de manter a viabilidade pós reconstituição. Portanto, foram testados diversos protocolos de extração e liofilização. Para validação do PRP canino liofilizado foi analisada a concentração dos fatores de crescimento VEGF e TGF- antes e após o processo de liofilização, a estrutura tridimensional do PRP liofilizado reconstituído em forma de gel por microscopia eletrônica e seu efeito in vitro na proliferação de células-tronco mesenquimais. Os resultados demonstraram que o PRP liofilizado apresentou concentrações terapêuticas adequadas dos fatores de crescimento VEGF e TGF- (9,1pg/ml e 6161,6pg/ml, respectivamente). O gel de PRP reconstituído após liofilização apresentou uma durabilidade in vitro de 10 dias, sua estrutura tridimensional mostrou-se semelhante ao PRP fresco e proporcionou intensa proliferação de células-tronco mesenquimais durante o cultivo. O teste de imunogenicidade não demonstrou evidências de reação imune. Os achados foram promissores, sugerindo a possibilidade de uso de PRP canino liofilizado para o mercado. Novos estudos in vivo e in vitro deverão ser conduzidos para comprovação terapêutica.

In-vitro production and pre-validation of lyophilized canine platelet-rich plasma for therapeutic use / Produção e validação de plasma rico em plaquetas canino liofilizado para fins de utilização terapêutica

Platelet-rich plasma (PRP) has been considered a promising therapeutic alternative, since platelets are rich in growth factors that are used in the Regenerative Medicine field. However, fresh PRP cannot be stored for long periods. This study aimed to develop a protocol for obtaining lyophilized canine PRP capable of maintaining viability after its reconstitution. For that purpose, canine PRP extraction and lyophilization protocols were initially tested. Subsequently, assays were carried out to quantify the growth factors VEGF and TGF-β, before and after the lyophilization process, gelation test and the three-dimensional gel structure analysis of the reconstituted lyophilized PRP by electron microscopy, as well as in vitro cell proliferation test in lyophilized PRP gel. Additionally, the immunogenicity test was performed, using allogeneic samples of lyophilized PRP. The results showed that the lyophilized PRP had adequate therapeutic concentrations of growth factors VEGF and TGF-β (9.1pg/mL and 6161.6pg/mL, respectively). The reconstituted PRP gel after lyophilization showed an in vitro durability of 10 days. Its electron microscopy structure was similar to that of fresh PRP. In the cell proliferation test, an intense division process was verified in mesenchymal stem cells (MSCs) through the three-dimensional mesh structure of the lyophilized PRP gel. The immunogenicity test showed no evidence of an immune reaction. The findings were promising, suggesting the possibility of having a lyophilized canine PRP that can be marketed. New in vivo and in vitro studies must be carried out for therapeutic confirmation.(AU)

O plasma rico em plaquetas (PRP) é uma alternativa terapêutica promissora, pois as plaquetas são ricas em fatores de crescimento com ação na regeneração de tecidos. No entanto, o PRP fresco não pode ser armazenado por longos períodos. Esse trabalho teve como objetivo desenvolver um protocolo de obtenção de PRP liofilizado canino capaz de manter a viabilidade pós reconstituição. Portanto, foram testados diversos protocolos de extração e liofilização. Para validação do PRP canino liofilizado foi analisada a concentração dos fatores de crescimento VEGF e TGF-β antes e após o processo de liofilização, a estrutura tridimensional do PRP liofilizado reconstituído em forma de gel por microscopia eletrônica e seu efeito in vitro na proliferação de células-tronco mesenquimais. Os resultados demonstraram que o PRP liofilizado apresentou concentrações terapêuticas adequadas dos fatores de crescimento VEGF e TGF- β (9,1pg/ml e 6161,6pg/ml, respectivamente). O gel de PRP reconstituído após liofilização apresentou uma durabilidade in vitro de 10 dias, sua estrutura tridimensional mostrou-se semelhante ao PRP fresco e proporcionou intensa proliferação de células-tronco mesenquimais durante o cultivo. O teste de imunogenicidade não demonstrou evidências de reação imune. Os achados foram promissores, sugerindo a possibilidade de uso de PRP canino liofilizado para o mercado. Novos estudos in vivo e in vitro deverão ser conduzidos para comprovação terapêutica.(AU)

A L-arginina na produção in vitro de embriões bovinos: perspectivas para o futuro / L-arginine in the in vitro production of bovine embryos: perspectives for the future

A L-arginina (L-arg) é o principal precursor da síntese do NO, contudo, é precursora também da síntese de creatina, agmatina, ureia, síntese proteica, L-ornitina, poliaminas, L-prolina e L-glutamato. Nesta breve revisão, vamos falar de alguns resultados que estão sendo obtidos sobre o papel da L-arg na capacitação de espermatozoides bovinos e seu impacto na produção in vitro de embriões. Estudos in vitro mostraram que a adição de L-arg ao meio de capacitação espermática está associada a um aumento na produção de NO, que se correlaciona com aumento da motilidade e vigor, integridade da membrana plasmática e acrossomal, atividade mitocondrial, capacitação espermática, peroxidação lipídica, bem como com a produção de blastocistos. Além disso, a adição da L-arg ao meio de capacitação in vitro, altera o perfil de proteínas importantes ligadas ao processo de capacitação, fertilização e desenvolvimento embrionário inicial. Estes efeitos da L-arg são GMPc dependentes e independentes. Na maturação in vitro, entretanto, embora já tenham sido encontrados bons resultados com o uso do L-arg, mais estudos são necessários para determinar a concentração ideal a ser adicionada ao meio de maturação in vitro e seu impacto na produção de blastocistos. Visto que a pré-capacitação de espermatozoides induzida pela heparina em presença de L-arg foi o método mais eficiente na produção in vitro de embriões, sugerimos sua utilização. Mais pesquisas sobre o metabolismo da L-arg no espermatozoide e CCOs de bovinos durante eventos ligados à fertilização são necessários para se identificar novas vias que atuem nestas etapas in vitro visando o aumento da percentagem e qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro.

L-arginine (L-arg) is the main source of NO synthesis; however, it is also a precursor of the synthesis of creatine, agmatine, urea, protein synthesis, L-ornithine, polyamines, L-proline, and Lglutamate. In this brief review, we will discuss some results obtained previously about the role of L-arg in the capacitation of bovine sperm and its impact on in vitro embryo production. In vitro studies have shown that the addition of L-arg to the sperm capacitation medium is associated with an increase in NO production, which in controlled levels is related to an increased motility and vigor, plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial activity, sperm capacitation, peroxidation lipids, as well as with the blastocyst production. Furthermore, the addition of L-arg to the in vitro capacitation medium alters the profile of important proteins linked to the capacitation process, fertilization, and early embryonic development. These effects of L-arg are cGMP dependent and independent. In in vitro maturation, however, although good results have already been found with the use of L-arg, further studies are needed to determine the ideal concentration to be added to the in vitro maturation medium and its impact on the production of blastocysts. Since heparin-induced pre-capacitation of spermatozoa in the presence of L-arg was the most efficient method for in vitro embryo production, we suggest its use. More research on L-arg metabolism in bovine sperm and OCCs during events related to fertilization is needed to identify new pathways that act in these in vitro steps aiming to increase the percentage and quality of bovine embryos produced in vitro.

Influence of different protein supplements on the recovery and in vitro maturation of bovine oocytes / Influencia de diferentes suplementos proteicos en la recuperación y maduración in vitro de ovocitos bovinos / Influência de diferentes suplementações proteicas sobre a recuperação e maturação in vitro de oócitos bovinos

Abstract Background: Oocyte quality and maturation are influenced by protein supplementation. Objective: To evaluate the influence of fetal bovine serum (FBS) and bovine serum albumin (BSA) concentrations on the recovery and in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes. Methods: The study was divided into Stage 1 (oocyte recovery), and Stage 2 (IVM). In the first stage, three experiments were conducted according to the recovery (R) medium used: (R1) 10 vs. 20% FBS; (R2) 5 vs. 10% BSA; and (R3) the best results from R1, R2, and the combination of FBS+BSA (5+5%). Within the second stage, the maturation medium was supplemented according to three experiments: (M1) 5 vs. 10% FBS; (M2) 0.4 vs. 0.8% BSA; and (M3) better results of M1, M2, and the combination of FBS+BSA (5+0.8%). Results: In Stage 1 (R1 and R2), the media with 10% FBS and 10% BSA showed better oocyte quality results and were defined for experiment R3. In R3, the 10% FBS and the combination of FBS+BSA (5+5%) allowed recovery of better-quality oocytes. In Stage 2 (M1 and M2), media with both levels of FBS (5 and 10%) and 0.8% BSA were defined as better according to the maturation and viability rates of cumulus cells, so they were defined for experiment M3. In M3, no difference was noted among the supplements. Conclusions: For oocyte recovery, 10% FBS and the combination of FBS+BSA (5+5%) can be used to obtain immature oocytes. For the in vitro maturation, FBS (both levels, 5 and 10%) and BSA (0.8%) can be used alone or in combination.

Resumen Antecedentes: La calidad y maduración de los ovocitos son influenciados por la suplementación proteica. Objetivo: Evaluar la influencia de concentraciones de suero fetal bovino (FBS) y albúmina sérica bovina (BSA) en la recuperación y maduración in vitro (IVM) de ovocitos bovinos. Métodos: El estudio se dividió en Etapa 1 (recuperación de ovocitos) y Etapa 2 (IVM). En la primera etapa, tres experimentos se realizaron de acuerdo con el medio de recuperación: (R1) 10 vs. 20% FBS; (R2) 5 vs. 10% BSA; y (R3) los mejores resultados de R1, R2 y la combinación de FBS+BSA (5+5%). En la segunda etapa, el medio de maduración fue suplementado para tres experimentos: (M1) 5 vs. 10% FBS; (M2) 0,4 vs. 0,8% BSA; y (M3) mejores resultados de M1, M2 y la combinación de FBS+BSA (5+0,8%). Resultados: En la Etapa 1 (R1 y R2), los medios con 10% FBS y 10% BSA mostraron mejores resultados de calidad oocitaria y fueron definidos para el experimento R3. En R3, 10% FBS y la combinación de FBS+BSA (5+5%) permitieron la recuperación de ovocitos de mejor calidad. En la Etapa 2 (M1 y M2), los medios con ambos niveles de FBS (5 y 10%) y 0,8% de BSA se definieron como mejores de acuerdo con las tasas de maduración y viabilidad de las células del cumulus, por lo que se definieron para el experimento M3. En M3, no se observó diferencia entre los suplementos. Conclusiones: Para la recuperación de ovocitos, se puede utilizar 10% de FBS y la combinación de FBS+BSA (5+5%) para obtener ovocitos inmaduros. Para la maduración in vitro, FBS (ambos niveles, 5 y 10%) y BSA (0,8%) se pueden usar solos o en combinación.

Resumo Antecedentes: A qualidade e a maturação de oócitos são influenciadas pela suplementação proteica. Objetivo: Avaliar a influência de concentrações de soro fetal bovino (FBS) e albumina sérica bovina (BSA) sobre a recuperação e maturação in vitro (IVM) de oócitos bovinos. Métodos: O estudo foi dividido em Etapa 1 (recuperação de oócitos) e Etapa 2 (IVM). Na primeira etapa, três experimentos foram realizados de acordo com o meio de recuperação: (R1) 10 vs. 20% FBS; (R2) 5 vs. 10% BSA; e (R3) melhores resultados de R1, R2 e a combinação de FBS+BSA (5+5%). Na segunda etapa, o meio de maturação foi suplementado de acordo com três experimentos: (M1) 5 vs. 10% FBS; (M2) 0,4 vs. 0,8% BSA; e (M3) melhores resultados de M1, M2 e a combinação de FBS+BSA (5+0,8%). Resultados: Na Etapa 1 (R1 e R2), os meios com 10% FBS e 10% BSA mostraram melhores resultados de qualidade oocitária e foram definidos para o experimento R3. Em R3, 10% FBS e a combinação de FBS+BSA (5+5%) permitiram a recuperação de oócitos de melhor qualidade. Na segunda etapa (M1 e M2), meios com ambos os níveis de FBS (5 e 10%) e 0,8% BSA foram definidos como os melhores de acordo com as taxas de maturação e viabilidade de células do cumulus, então foram definidos para o experimento M3. No M3, não houve diferença entre os suplementos. Conclusões: Para a recuperação oocitária, 10% FBS e a combinação de FBS+BSA (5+5%) podem ser usados para obter oócitos imaturos. Para maturação in vitro, FBS (ambos os níveis, 5 e 10%) e BSA (0,8%) podem ser usados sozinhos ou em combinação.

Quantificação do DNA e genotipagem de biópsias de embriões bovinos Gir e Girolando produzidos in vitro / DNA quantification and genotyping of biopsies obtained from Gyr and Girolando in vitro produced bovine embryos

A biópsia embrionária associada à genotipagem permite a obtenção de informações genômicas antes mesmo da transferência dos embriões. Neste estudo, foram avaliadas amostras biopsiadas de blastocistos bovinos transferidos para receptoras (n=47), sob a hipótese de que a raça (Gir ou Girolando), o estádio embrionário (blastocisto ou blastocisto expandido) e a competência para estabelecimento de prenhez (positiva ou negativa) afetariam a quantidade e a qualidade do DNA da amostra obtida. O DNA foi extraído, amplificado, quantificado por eletroferograma e genotipado. O parâmetro call rate (CR) foi adotado para mensurar a qualidade da genotipagem. Obteve-se concentração de DNA de 86,07±171,66ng/µL e CR 0,73±0,17. O CR não variou em função da quantidade de DNA nas amostras. As variáveis raça e estádio embrionário não influenciaram a concentração de DNA, nem o CR. Houve efeito da prenhez sobre o CR (P=0,0187), mas, como houve maior CR nas amostras provenientes do grupo prenhez negativa, não foi possível associar esse parâmetro à qualidade embrionária. Concluiu-se que a raça e a qualidade embrionária não afetam os parâmetros aqui estudados em amostras embrionárias, ou seja, embriões com maiores chances de implantação não refletem alta qualidade nas amostras de biópsia genotipadas.(AU)

Embryo biopsy associated with genotyping allows genomic information before embryo transfer. In this study, blastocyst biopsy samples from embryos transferred to recipients (n= 47) were evaluated, under the hypothesis that breed (Gyr or Girolando), embryonic stage (blastocyst or expanded blastocyst) and competence to establish pregnancy (positive or negative) would affect the quantity and DNA quality of samples. DNA was extracted, amplified, quantified by electropherogram and genotyped. The parameter call rate (CR) was used to measure the quality of genotyping. DNA concentration of 86.07±171.66ng/µl, and CR 0.73±0.17 was obtained. CR did not vary according to the amount of DNA in the samples. The variables breed and embryonic stage had no influence on DNA concentration or CR. There was pregnancy effect on the CR (P= 0.0187), but since there was a higher CR in the samples from the negative pregnancy group, it was not possible to associate this parameter with the embryonic quality. We conclude that the breed and embryo quality do not affect the evaluated parameters in embryonic samples. Embryos with higher chances of implantation do not reflect high quality in embryo biopsy genotyped samples.(AU)

Quantificação do DNA e genotipagem de biópsias de embriões bovinos Gir e Girolando produzidos in vitro / DNA quantification and genotyping of biopsies obtained from Gyr and Girolando in vitro produced bovine embryos

A biópsia embrionária associada à genotipagem permite a obtenção de informações genômicas antes mesmo da transferência dos embriões. Neste estudo, foram avaliadas amostras biopsiadas de blastocistos bovinos transferidos para receptoras (n=47), sob a hipótese de que a raça (Gir ou Girolando), o estádio embrionário (blastocisto ou blastocisto expandido) e a competência para estabelecimento de prenhez (positiva ou negativa) afetariam a quantidade e a qualidade do DNA da amostra obtida. O DNA foi extraído, amplificado, quantificado por eletroferograma e genotipado. O parâmetro call rate (CR) foi adotado para mensurar a qualidade da genotipagem. Obteve-se concentração de DNA de 86,07±171,66ng/µL e CR 0,73±0,17. O CR não variou em função da quantidade de DNA nas amostras. As variáveis raça e estádio embrionário não influenciaram a concentração de DNA, nem o CR. Houve efeito da prenhez sobre o CR (P=0,0187), mas, como houve maior CR nas amostras provenientes do grupo prenhez negativa, não foi possível associar esse parâmetro à qualidade embrionária. Concluiu-se que a raça e a qualidade embrionária não afetam os parâmetros aqui estudados em amostras embrionárias, ou seja, embriões com maiores chances de implantação não refletem alta qualidade nas amostras de biópsia genotipadas.(AU)

Embryo biopsy associated with genotyping allows genomic information before embryo transfer. In this study, blastocyst biopsy samples from embryos transferred to recipients (n= 47) were evaluated, under the hypothesis that breed (Gyr or Girolando), embryonic stage (blastocyst or expanded blastocyst) and competence to establish pregnancy (positive or negative) would affect the quantity and DNA quality of samples. DNA was extracted, amplified, quantified by electropherogram and genotyped. The parameter call rate (CR) was used to measure the quality of genotyping. DNA concentration of 86.07±171.66ng/µl, and CR 0.73±0.17 was obtained. CR did not vary according to the amount of DNA in the samples. The variables breed and embryonic stage had no influence on DNA concentration or CR. There was pregnancy effect on the CR (P= 0.0187), but since there was a higher CR in the samples from the negative pregnancy group, it was not possible to associate this parameter with the embryonic quality. We conclude that the breed and embryo quality do not affect the evaluated parameters in embryonic samples. Embryos with higher chances of implantation do not reflect high quality in embryo biopsy genotyped samples.(AU)

Influência da progesterona injetável na taxa de prenhez de novilhas receptoras de embriões bovinos / Influence of injectable progesterone on the pregnancy rate of heifers receiving bovine embryos

Background: In vitro embryo production (IVEP) allows the spread of superior animal genetics, but pregnancy rates show a high variability with this biotechnique. In the initial stage of pregnancy, progesterone plays a fundamental role in uterine preparation, acting on embryonic growth, implantation, and development. However, on the day of the IVEP transfer to the recipients, progesterone levels may be lower than that expected, influencing the uterine environment and, consequently, the pregnancy rate. Therefore, the objective of this study was to evaluate the pregnancy rate in heifers after the administration of injectable progesterone (P4) in the fixed-time embryo transfer (FTET) protocol. Materials, Methods & Results: The experiment was conducted inside a rural property near the city of Rio Branco, Acre, Brazil. The experimental group consisted of 232 animals, including 78 zebuine (Bos indicus) and 154 mixed (½ blood B. indicus and ½ blood B. taurus) animals, aged between 16 and 24 months, with a mean weight of 300 and 330 kg for zebuine and mixed animals, respectively. The selected animals were previously synchronized using the progesteroneestrogen-prostaglandin-estrogen protocol. Embryo transfer was performed on day 18 of the protocol, which was 9 days after the removal of intravaginal progesterone implant. On day 15 of the protocol, that is, 144 h (6 days) after the device removal, the animals were randomly distributed into two experimental groups: Control Group (CG; 0.5 mL of 0.9% saline solution, intramuscular) and Treated Group (P4G; 0.5 mL of injectable P4, 150 mg, intramuscular). Chi-square test was used for the statistical analysis of the pregnancy rate at a 5% probability. After 23 days of embryo transfer, pregnancy was diagnosed by ultrasonography. The general pregnancy rate, considering all groups (CG and P4G) and breeds included, was 55.17% (128/232). The pregnancy rates of the P4G and CG groups, regardless of breeds, were...

Maturação in vitro de oócitos bovinos é negativamente afetada por CHIR99021, inibidor específico de GSK3 / In vitro maturation of bovine oocytes is negatively affected by CHIR99021, a specific inhibitor of GSK3

A enzima glicogênio sintase quinase-3 (GSK3) atua em várias vias de sinalização pela fosforilação e desfosforilação de proteínas, participando de várias funções celulares. Poucos estudos descrevem sua participação na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos, mas sabe-se que sua inibição inespecífica tem um impacto negativo nesse processo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de CHIR99021, inibidor específico da GSK3, em diferentes aspectos da MIV de complexos de cumulusoócito (CCOs) bovino e seu impacto na produção in vitro. Os CCOs foram aspirados de ovários de vacas abatidas e maturados em meio suplementado com 0; 1,5; 3,0 e 6,0 μM de CHIR99021. A análise estatística dos resultados por regressão linear (p≤0,01) mostrou que após 22 h de MIV, o tratamento causou redução dose-dependente no grau de expansão das células cumulus; na viabilidade de oócitos avaliada por coloração com calceína-AM e iodeto de propídio; nas taxas de maturação nuclear, e migração de grânulos corticais avaliadas por marcação com orceína acética a 2% e com lectina Lens culinaris-FITC (LCA), respectivamente, além de uma redução na produção de blastocistos. Assim, conclui-se que o CHIR99021 interfere negativamente, de forma dose-dependente na MIV de oócitos bovinos, sugerindo a importância da GSK3 na maturação nuclear e citoplasmática, com consequente impacto para a produção in vitro de embriões bovinos.(AU)

The enzyme glycogen synthase kinase-3 (GSK3) acts in several signaling pathway through phosphorylation and protein dephosphorylation, participating in various cellular functions. Few studies describe its participation in the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes, but its nonspecific inhibition is known to have a negative impact on this process. The objective of this work was to evaluate the effect of CHIR99021, specific inhibition of GSK3, on different aspects of the in vitro maturation of bovine cumulus-oocyte (COCs) complexes. COCs were aspirated from ovaries of slaughtered cows and matured in medium supplemented with0; 1.5; 3.0 and 6.0 μM CHIR99021. Statistical analysis of the results by linear regression (p≤0.01) showed that after 22 hours of IVM the treatment caused dose-dependent reduction in the degree of cumulus cell expansion; oocyte viability evaluated by staining with calcein-AM and propidium iodide; rates of nuclear maturation and migration of cortical granules evaluated by labeling with 2% acetic orcein and Lens culinaris-FITC (LCA), respectively; and a reduction in the of blastocyst rate. It is concluded that CHIR99021 interferes negatively, in a dose-dependent manner in the IVM of bovine oocytes, suggesting the importance of GSK3 in nuclear and cytoplasmic maturation, with a consequent impact on the in vitro bovine embryos production.(AU)

Substituição parcial do soro fetal bovino durante cultivo in vitro reduz a concentração de fosfolipídios em embriões bovinos produzidos in vitro / Partial replacement of fetal bovine serum during in vitro culture decreases phospholipid content in in vitro produced bovine embryos

Soro fetal bovino (SFB) e albumina sérica bovina (BSA) são componentes importantes do cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos, porém são frequentemente associados ao acúmulo excessivo de lipídios, podendo prejudicar o desenvolvimento embrionário. Este estudo teve como objetivo substituir parcialmente o SFB por BSA V FAF durante o CIV de embriões bovinos, avaliar a produção embrionária e quantificar os lipídios dos embriões, SFB e dos meios de cultivo. Para isto, os embriões desenvolveram em meios de cultivo suplementados com 10% de SFB (SFB10%) ou 5% de SFB e 0.03g de BSA V FAF (SFB5%/BSA). O conteúdo lipídico foi avaliado por UHPLC-MS/MS. A análise estatística foi feita utilizando teste t e ANOVA. A substituição parcial de SFB por BSA V FAF não alterou a produção embrionária. Nos dois grupos foram identificados 10 fosfolipídios e três deles, DOPC (p=0,037), POPG (p=0,046) e C24: 1-SM (p=0,009), apresentaram menores concentrações no meio SFB5%/BSA. Os fosfolipídios identificados nos embriões coincidem com os encontrados no SFB e meios de cultivo e quatro deles DOPC (p=0,013), DPPC (p=0,004), POPG (p=0,05) e C24:1-SM (p=0,003) diminuíram a concentração com a redução do SFB. A substituição parcial do SFB diminui a concentração de fosfolipídios sem prejudicar a produção embrionária, sugerindo uma melhora nas técnicas relacionadas ao cultivo in vitro.(AU)

Fetal bovine serum (FBS) and bovine serum albumin (BSA) are important components during bovine embryo in vitro culture (IVC), but they are associated with excess of embryonic lipid, which might impair embryo development. This study aimed to partially replace FBS by BSA V FAF during bovine IVC, evaluate embryo production and quantify the phospholipid content in produced embryos, SFB and IVC medium. The embryos were in vitro cultured in medium supplied with 10% of FBS (FBS10%) or with 5% of FBS plus 0.03 g BSA V FAF (FBS5%/BSA). The lipid content was evaluated using UHPLC-MS/MS and statistical analysis was performed using t-test and ANOVA. The partial replacement of FBS by BSA V FAF did not alter embryo production. Ten phospholipids were identified in both groups and three of them, DOPC (p=0.037), POPG (p=0.046) and C24: 1-SM (p=0.009) presented lower concentration in FBS5%/BSA culture medium. The phospholipids identified on embryos matches with those found on SFB and culture medium and four of them DOPC (p=0.013), DPPC (p=0.004), POPG (p=0.05) and C24:1- SM (p=0.003) reduced its concentration when FBS was reduced. Theses founds shown that the FBS partial replacement reduces phospholipids content in embryos but do not decrease embryo production, suggesting a technical improvement.(AU)

Substituição parcial do soro fetal bovino durante cultivo in vitro reduz a concentração de fosfolipídios em embriões bovinos produzidos in vitro / Partial replacement of fetal bovine serum during in vitro culture decreases phospholipid content in in vitro produced bovine embryos

Soro fetal bovino (SFB) e albumina sérica bovina (BSA) são componentes importantes do cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos, porém são frequentemente associados ao acúmulo excessivo de lipídios, podendo prejudicar o desenvolvimento embrionário. Este estudo teve como objetivo substituir parcialmente o SFB por BSA V FAF durante o CIV de embriões bovinos, avaliar a produção embrionária e quantificar os lipídios dos embriões, SFB e dos meios de cultivo. Para isto, os embriões desenvolveram em meios de cultivo suplementados com 10% de SFB (SFB10%) ou 5% de SFB e 0.03g de BSA V FAF (SFB5%/BSA). O conteúdo lipídico foi avaliado por UHPLC-MS/MS. A análise estatística foi feita utilizando teste t e ANOVA. A substituição parcial de SFB por BSA V FAF não alterou a produção embrionária. Nos dois grupos foram identificados 10 fosfolipídios e três deles, DOPC (p=0,037), POPG (p=0,046) e C24: 1-SM (p=0,009), apresentaram menores concentrações no meio SFB5%/BSA. Os fosfolipídios identificados nos embriões coincidem com os encontrados no SFB e meios de cultivo e quatro deles DOPC (p=0,013), DPPC (p=0,004), POPG (p=0,05) e C24:1-SM (p=0,003) diminuíram a concentração com a redução do SFB. A substituição parcial do SFB diminui a concentração de fosfolipídios sem prejudicar a produção embrionária, sugerindo uma melhora nas técnicas relacionadas ao cultivo in vitro.

Fetal bovine serum (FBS) and bovine serum albumin (BSA) are important components during bovine embryo in vitro culture (IVC), but they are associated with excess of embryonic lipid, which might impair embryo development. This study aimed to partially replace FBS by BSA V FAF during bovine IVC, evaluate embryo production and quantify the phospholipid content in produced embryos, SFB and IVC medium. The embryos were in vitro cultured in medium supplied with 10% of FBS (FBS10%) or with 5% of FBS plus 0.03 g BSA V FAF (FBS5%/BSA). The lipid content was evaluated using UHPLC-MS/MS and statistical analysis was performed using t-test and ANOVA. The partial replacement of FBS by BSA V FAF did not alter embryo production. Ten phospholipids were identified in both groups and three of them, DOPC (p=0.037), POPG (p=0.046) and C24: 1-SM (p=0.009) presented lower concentration in FBS5%/BSA culture medium. The phospholipids identified on embryos matches with those found on SFB and culture medium and four of them DOPC (p=0.013), DPPC (p=0.004), POPG (p=0.05) and C24:1- SM (p=0.003) reduced its concentration when FBS was reduced. Theses founds shown that the FBS partial replacement reduces phospholipids content in embryos but do not decrease embryo production, suggesting a technical improvement.

Maturação in vitro de oócitos bovinos é negativamente afetada por CHIR99021, inibidor específico de GSK3 / In vitro maturation of bovine oocytes is negatively affected by CHIR99021, a specific inhibitor of GSK3

A enzima glicogênio sintase quinase-3 (GSK3) atua em várias vias de sinalização pela fosforilação e desfosforilação de proteínas, participando de várias funções celulares. Poucos estudos descrevem sua participação na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos, mas sabe-se que sua inibição inespecífica tem um impacto negativo nesse processo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de CHIR99021, inibidor específico da GSK3, em diferentes aspectos da MIV de complexos de cumulusoócito (CCOs) bovino e seu impacto na produção in vitro. Os CCOs foram aspirados de ovários de vacas abatidas e maturados em meio suplementado com 0; 1,5; 3,0 e 6,0 μM de CHIR99021. A análise estatística dos resultados por regressão linear (p≤0,01) mostrou que após 22 h de MIV, o tratamento causou redução dose-dependente no grau de expansão das células cumulus; na viabilidade de oócitos avaliada por coloração com calceína-AM e iodeto de propídio; nas taxas de maturação nuclear, e migração de grânulos corticais avaliadas por marcação com orceína acética a 2% e com lectina Lens culinaris-FITC (LCA), respectivamente, além de uma redução na produção de blastocistos. Assim, conclui-se que o CHIR99021 interfere negativamente, de forma dose-dependente na MIV de oócitos bovinos, sugerindo a importância da GSK3 na maturação nuclear e citoplasmática, com consequente impacto para a produção in vitro de embriões bovinos.

The enzyme glycogen synthase kinase-3 (GSK3) acts in several signaling pathway through phosphorylation and protein dephosphorylation, participating in various cellular functions. Few studies describe its participation in the in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes, but its nonspecific inhibition is known to have a negative impact on this process. The objective of this work was to evaluate the effect of CHIR99021, specific inhibition of GSK3, on different aspects of the in vitro maturation of bovine cumulus-oocyte (COCs) complexes. COCs were aspirated from ovaries of slaughtered cows and matured in medium supplemented with0; 1.5; 3.0 and 6.0 μM CHIR99021. Statistical analysis of the results by linear regression (p≤0.01) showed that after 22 hours of IVM the treatment caused dose-dependent reduction in the degree of cumulus cell expansion; oocyte viability evaluated by staining with calcein-AM and propidium iodide; rates of nuclear maturation and migration of cortical granules evaluated by labeling with 2% acetic orcein and Lens culinaris-FITC (LCA), respectively; and a reduction in the of blastocyst rate. It is concluded that CHIR99021 interferes negatively, in a dose-dependent manner in the IVM of bovine oocytes, suggesting the importance of GSK3 in nuclear and cytoplasmic maturation, with a consequent impact on the in vitro bovine embryos production.

Avaliação distribuição mitocondrial na maturação in vitro de oócitos bovinos de ovários com baixa e alta contagem de folículos antrais / Mitochondrial distribution evaluation in vitro maturation of ovarian bovine oocytes with low and high antral follicle count

A Produção in vitro de embriões (PIVE) depende das etapas de maturação, fertilização e cultivo in vitro, sendo a maturação a etapa decisiva para o oócito atingir o estádio de mórula e blastocisto. Neste trabalho objetivou-se avaliar a qualidade de maturação in vitro, de acordo com a distribuição mitocondrial de oócitos provenientes de ovários de fêmeas de abatedouro, com baixa ou alta contagem de folículos antrais (CFA). Foram aspirados 243 ovários dos quais se selecionou 334 oócitos perante de cinco repetições para cada grupo. Os ovários foram separados em dois grupos: 1-baixa CFA (n=19), 2-alta CFA (n= 53) e os oócitos recuperados corados com a sonda MitoTracker Red. Os dados obtidos foram analisados pelo teste não paramétrico exato de Fisher (α=5%) mediante o software Statistical Analysis System for Windows (SAS Inst., Inc., Cary, NC).Em relação a localização das mitocôndrias o presente trabalho apresentou diferenças (p<0,001) entre oócitos imaturos e maturados, o que é desejável. Oócitos maturados apresentaram maior porcentagem de mitocôndrias dispersas no citoplasma e oócitos imaturos na periferia, independente do grupo experimental (baixa e alta CFA). Em oócitos imaturos, não houve diferença (p=0,1542) na localização das mitocôndrias entre os grupos baixa e alta CFA. No entanto, o grupo baixa CFA, após a maturação, apresentou menor quantidade de oócitos com mitocôndrias na periferia em relação aos de alta CFA (p = 0,0355), indicando melhor aquisição de competência desses oócitos para PIVE.

In vitro embryo production (PIVE) depends on the stages of maturation, fertilization and in vitro cultivation, being the decisive stage for the oocyte to reach the morula and blastocyst stage. This study aimed to evaluate the quality of in vitro maturation, according to the mitochondrial distribution of oocytes from ovaries of slaughter females with low or high antral follicle count (CFA). A total of 243 ovaries were aspirated from which 334 oocytes were selected for five replicates for each group. The ovaries were separated into two groups: 1-low CFA (n = 19) 2-high CFA (n = 53) and stained with the Mito Traker Red probe. Data obtained were analyzed by Fisher's exact nonparametric test ( α= 5%) using the Statistical Analysis System for Windows software (SAS Inst., Inc., Cary, NC). Regarding the location of mitochondria, the present study showed significant differences (p <0.001) between immature and mature oocytes, which is desirable. Mature oocytes had a higher percentage of dispersed mitochondria in the cytoplasm and immature oocytes in the periphery, regardless of the experimental group (low and high CFA). In immature oocytes, there was no difference (p = 0.1542) in the location of mitochondria between the low and high CFA groups. However, the oocytes of the low CFA group, after maturation, presented smaller number of oocytes with mitochondria in the periphery compared to the high CFA (p = 0.0355), indicating for this parameter a better competence of these oocytes for PIVE.

Avaliação distribuição mitocondrial na maturação in vitro de oócitos bovinos de ovários com baixa e alta contagem de folículos antrais / Mitochondrial distribution evaluation in vitro maturation of ovarian bovine oocytes with low and high antral follicle count

A Produção in vitro de embriões (PIVE) depende das etapas de maturação, fertilização e cultivo in vitro, sendo a maturação a etapa decisiva para o oócito atingir o estádio de mórula e blastocisto. Neste trabalho objetivou-se avaliar a qualidade de maturação in vitro, de acordo com a distribuição mitocondrial de oócitos provenientes de ovários de fêmeas de abatedouro, com baixa ou alta contagem de folículos antrais (CFA). Foram aspirados 243 ovários dos quais se selecionou 334 oócitos perante de cinco repetições para cada grupo. Os ovários foram separados em dois grupos: 1-baixa CFA (n=19), 2-alta CFA (n= 53) e os oócitos recuperados corados com a sonda MitoTracker Red. Os dados obtidos foram analisados pelo teste não paramétrico exato de Fisher (α=5%) mediante o software Statistical Analysis System for Windows (SAS Inst., Inc., Cary, NC).Em relação a localização das mitocôndrias o presente trabalho apresentou diferenças (p<0,001) entre oócitos imaturos e maturados, o que é desejável. Oócitos maturados apresentaram maior porcentagem de mitocôndrias dispersas no citoplasma e oócitos imaturos na periferia, independente do grupo experimental (baixa e alta CFA). Em oócitos imaturos, não houve diferença (p=0,1542) na localização das mitocôndrias entre os grupos baixa e alta CFA. No entanto, o grupo baixa CFA, após a maturação, apresentou menor quantidade de oócitos com mitocôndrias na periferia em relação aos de alta CFA (p = 0,0355), indicando melhor aquisição de competência desses oócitos para PIVE.(AU)

In vitro embryo production (PIVE) depends on the stages of maturation, fertilization and in vitro cultivation, being the decisive stage for the oocyte to reach the morula and blastocyst stage. This study aimed to evaluate the quality of in vitro maturation, according to the mitochondrial distribution of oocytes from ovaries of slaughter females with low or high antral follicle count (CFA). A total of 243 ovaries were aspirated from which 334 oocytes were selected for five replicates for each group. The ovaries were separated into two groups: 1-low CFA (n = 19) 2-high CFA (n = 53) and stained with the Mito Traker Red probe. Data obtained were analyzed by Fisher's exact nonparametric test ( α= 5%) using the Statistical Analysis System for Windows software (SAS Inst., Inc., Cary, NC). Regarding the location of mitochondria, the present study showed significant differences (p <0.001) between immature and mature oocytes, which is desirable. Mature oocytes had a higher percentage of dispersed mitochondria in the cytoplasm and immature oocytes in the periphery, regardless of the experimental group (low and high CFA). In immature oocytes, there was no difference (p = 0.1542) in the location of mitochondria between the low and high CFA groups. However, the oocytes of the low CFA group, after maturation, presented smaller number of oocytes with mitochondria in the periphery compared to the high CFA (p = 0.0355), indicating for this parameter a better competence of these oocytes for PIVE.(AU)

Influência da contagem de folículos antrais na produção in vitro de embriões bovinos de doadoras Bos indicus e Bos taurus Revisão de literatura / Influence of the antral follicle count on bovine in vitro embryo production from Bos indicus and Bos taurus donors

A produção in vitro de embriões (PIVE) é uma biotécnica que se consolidou nos últimos anos e seu uso em bovinos continua a expandir-se, especialmente no Brasil. A facilidade em obter oócitos e as características do rebanho brasileiro foram determinantes para este crescimento. É conhecido que animais Bos taurus indicus e Bos taurus taurus possuem diferenças fisiológicas, metabólicas, endócrinas e comportamentais que impactam diretamente a reprodução. Além disso, a contagem de folículos antrais (CFA) é um parâmetro conhecidamente repetível no indivíduo, mas seu impacto na reprodução das fêmeas ainda não está completamente elucidado, especialmente considerando suas interações com a subespécie. O objetivo da presente revisão é destacar os mecanismos pelos quais estas características influenciam o rendimento e aplicabilidade da produção in vitro de embriões bovinos.(AU)

In vitro embryo production (IVP) is a well stablished biotechnic, and its use in bovines is still expanding, especially in Brazil. The facility to obtain oocytes associated to the breed characteristics of the Brazilian herd were decisive for this expansion. It is known that the physiology, metabolism, endocrinal system and behavior are different for Bos taurus indicus and Bos taurus taurus animals, and these differences may impact directly on the characteristics of reproduction of these animals. Furthermore, the antral follicle count (AFC) is known to present high repeatability on the same female, but its impact on the female reproduction remains unclear, either in the interaction between AFC and subspecies. The aim of this review is to highlight the mechanisms through which the AFC and subspecies may influence the income and feasibility of bovine in vitro embryo production.(AU)

Influência da contagem de folículos antrais na produção in vitro de embriões bovinos de doadoras Bos indicus e Bos taurus – Revisão de literatura / Influence of the antral follicle count on bovine in vitro embryo production from Bos indicus and Bos taurus donors

A produção in vitro de embriões (PIVE) é uma biotécnica que se consolidou nos últimos anos e seu uso em bovinos continua a expandir-se, especialmente no Brasil. A facilidade em obter oócitos e as características do rebanho brasileiro foram determinantes para este crescimento. É conhecido que animais Bos taurus indicus e Bos taurus taurus possuem diferenças fisiológicas, metabólicas, endócrinas e comportamentais que impactam diretamente a reprodução. Além disso, a contagem de folículos antrais (CFA) é um parâmetro conhecidamente repetível no indivíduo, mas seu impacto na reprodução das fêmeas ainda não está completamente elucidado, especialmente considerando suas interações com a subespécie. O objetivo da presente revisão é destacar os mecanismos pelos quais estas características influenciam o rendimento e aplicabilidade da produção in vitro de embriões bovinos.

In vitro embryo production (IVP) is a well stablished biotechnic, and its use in bovines is still expanding, especially in Brazil. The facility to obtain oocytes associated to the breed characteristics of the Brazilian herd were decisive for this expansion. It is known that the physiology, metabolism, endocrinal system and behavior are different for Bos taurus indicus and Bos taurus taurus animals, and these differences may impact directly on the characteristics of reproduction of these animals. Furthermore, the antral follicle count (AFC) is known to present high repeatability on the same female, but its impact on the female reproduction remains unclear, either in the interaction between AFC and subspecies. The aim of this review is to highlight the mechanisms through which the AFC and subspecies may influence the income and feasibility of bovine in vitro embryo production.

Use of a colloid to optimize centrifugation in the selection of bovine sperm for IVF / Uso de um coloide para otimizar a centrifugação na seleção de espermatozoides bovinos para FIV

This study aimed to evaluate the effect of the force and duration of centrifugation and the impact of cushioned centrifugation on sperm selection by Percoll gradient, on sperm quality and development kinetics of in vitro produced bovine embryos. Two experiments were performed. In Experiment I, a pool of semen was selected by Percoll gradients and the pellet was divided into four groups and distributed in a 2 × 2 factorial, with two forces (2200 × g or 9000 × g) and two durations (1 min or 3 min) of centrifugation. In Experiment II, semen was divided into two groups and selected by Percoll gradient with Cushion Fluid (CF) or without CF (Control) in the second centrifugation. The morphofunctionality, biochemical characteristics and fertilizing capacity of the selected sperms were evaluated. In addition, the development of the resulting bovine embryos was monitored for 48 h post-insemination. Duncan and Chi-square tests (P < 0.05) were used to compare the means. In Experiment I, there was a significant increase in sperm vigor (P < 0.05) after sperm selection in all treatments. The force and duration of centrifugation did not have any effect on sperm motility, vigor, and recovery rate among the different treatments (P > 0.05). In Experiment II, the recovery rate and reactive oxygen species (ROS) production in semen were similar among treatments (P > 0.05) although a higher ROS production was observed in the CF fertilization medium. Total fertilization rate was superior in the CF group (65.4 ± 5.3%) compared to that in Control (39.6 ± 4.9%). However, the normal fertilization and cleavage rate did not differ between the Control (94 ± 6.3% and 58.3 ± 8.3%) and CF (89 ± 7.1% and 75.0 ± 7.3%) groups. The reduction in the force and duration of centrifugation did not decrease the sperm recovery during selection by the Percoll gradient and the use of CF in the second centrifugation did not affect the normal fertilization and development of bovine IVF embryos up to 48 h.(AU)

Esse estudo objetivou avaliar o efeito da força e duração da centrifugação, e o impacto da centrifugação amortecida na seleção espermática por gradientes de Percoll, na qualidade espermática e cinética do desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro. Dois experimentos foram realizados. No experimento I, um pool de sêmen foi selecionado por gradientes de Percoll e o pellet dividido em quatro grupos e distribuído em um fatorial 2 x 2, com duas forças (2200 e 9000 X g) e dois tempos (1 e 3 min) de centrifugação. No Experimento II, o sêmen foi dividido em dois grupos e selecionado com (CF) ou sem CushionFluid (Controle) na segunda centrifugação. A morfofuncionalidade, características bioquímicas e capacidade fecundante dos espermatozoides selecionados foram avaliadas. Além disso, o desenvolvimento dos embriões bovinos resultantes foi monitorado por 48 horas pós-inseminação. Os testes Duncan e Qui-quadrado (P<0,05) foram usados para comparar as médias. No Experimento I, houve um aumento significativo no vigor após a seleção espermática para todos os tratamentos. A força e a duração da centrifugação não tiveram nenhum efeito na motilidade, vigor e recuperação espermática entre os diferentes tratamentos (P > 0.05). No Experimento II, a taxa de recuperação e a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) no sêmen foram similares entre os tratamentos (P>0,05), embora a maior produção de EROs foi observada no meio de fecundação do grupo CF. A taxa de fecundação total, foi superior no grupo CF (65.4±5.3%) comparada com o Controle (39.6±4.9%). Entretanto a fecundação normal e a taxa de clivagem não diferiram entre os grupos Controle (94±6.3% e 58.3±8.3%) e CF (89±7.1% and 75.0±7.3%). A redução na força e duração da centrifugação não diminuiu a recuperação espermática durante a seleção por gradientes de Percoll e o uso de CF na segunda centrifugação não influenciou a fecundação normal e o desenvolvimento de embriões bovinos PIV até 48 horas.(AU)

Use of a colloid to optimize centrifugation in the selection of bovine sperm for IVF / Uso de um coloide para otimizar a centrifugação na seleção de espermatozoides bovinos para FIV

This study aimed to evaluate the effect of the force and duration of centrifugation and the impact of cushioned centrifugation on sperm selection by Percoll gradient, on sperm quality and development kinetics of in vitro produced bovine embryos. Two experiments were performed. In Experiment I, a pool of semen was selected by Percoll gradients and the pellet was divided into four groups and distributed in a 2 × 2 factorial, with two forces (2200 × g or 9000 × g) and two durations (1 min or 3 min) of centrifugation. In Experiment II, semen was divided into two groups and selected by Percoll gradient with Cushion Fluid (CF) or without CF (Control) in the second centrifugation. The morphofunctionality, biochemical characteristics and fertilizing capacity of the selected sperms were evaluated. In addition, the development of the resulting bovine embryos was monitored for 48 h post-insemination. Duncan and Chi-square tests (P 0.05). In Experiment II, the recovery rate and reactive oxygen species (ROS) production in semen were similar among treatments (P > 0.05) although a higher ROS production was observed in the CF fertilization medium. Total fertilization rate was superior in the CF group (65.4 ± 5.3%) compared to that in Control (39.6 ± 4.9%). However, the normal fertilization and cleavage rate did not differ between the Control (94 ± 6.3% and 58.3 ± 8.3%) and CF (89 ± 7.1% and 75.0 ± 7.3%) groups. The reduction in the force and duration of centrifugation did not decrease the sperm recovery during selection by the Percoll gradient and the use of CF in the second centrifugation did not affect the normal fertilization and development of bovine IVF embryos up to 48 h.

Esse estudo objetivou avaliar o efeito da força e duração da centrifugação, e o impacto da centrifugação amortecida na seleção espermática por gradientes de Percoll, na qualidade espermática e cinética do desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro. Dois experimentos foram realizados. No experimento I, um pool de sêmen foi selecionado por gradientes de Percoll e o pellet dividido em quatro grupos e distribuído em um fatorial 2 x 2, com duas forças (2200 e 9000 X g) e dois tempos (1 e 3 min) de centrifugação. No Experimento II, o sêmen foi dividido em dois grupos e selecionado com (CF) ou sem CushionFluid (Controle) na segunda centrifugação. A morfofuncionalidade, características bioquímicas e capacidade fecundante dos espermatozoides selecionados foram avaliadas. Além disso, o desenvolvimento dos embriões bovinos resultantes foi monitorado por 48 horas pós-inseminação. Os testes Duncan e Qui-quadrado (P 0.05). No Experimento II, a taxa de recuperação e a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) no sêmen foram similares entre os tratamentos (P>0,05), embora a maior produção de EROs foi observada no meio de fecundação do grupo CF. A taxa de fecundação total, foi superior no grupo CF (65.4±5.3%) comparada com o Controle (39.6±4.9%). Entretanto a fecundação normal e a taxa de clivagem não diferiram entre os grupos Controle (94±6.3% e 58.3±8.3%) e CF (89±7.1% and 75.0±7.3%). A redução na força e duração da centrifugação não diminuiu a recuperação espermática durante a seleção por gradientes de Percoll e o uso de CF na segunda centrifugação não influenciou a fecundação normal e o desenvolvimento de embriões bovinos PIV até 48 horas.