Correlation of maternal concentrations of plasma testosterone with fetal sex in horses / Correlação das concentrações plasmáticas de testosterona materna com o sexo fetal em equinos

ABSTRACT: The objectives of this study were to evaluate the correlation of fetal sex and plasma testosterone concentrations between the 5th and 8th months of pregnancy in mares and to verify the applicability of this test to predict fetal sex. Blood samples were collected from 21 mares at 30-day intervals of between 150 and 240 days of pregnancy. Plasma testosterone was determined by radioimmunoassay and the sex of the foals confirmed at birth. The levels of maternal testosterone were higher in mares carrying female fetuses at months 5 and 8 (P < 0.05). Limit values were determined by analyzing the receiver operating characteristic (ROC) estimates: 35.5 pg/mL and 40 pg/mL for the 5th and 8th month, respectively. For the mares with plasma testosterone values equal to or above the threshold, gestation of female foals was predicted, and for those with plasma testosterone below the threshold values pregnancy of male foals was predicted. In the 5th month, the predictive values for male and female fetuses were 70% and 88.9%, respectively; the detection rates were 87.5% and 72.7%, and the total accuracy of the examination was 78.9%. In the 8th month, the predictive values for male and female fetuses were 80% and 90%, respectively; the detection rates were 88.9% and 81.8%, and the total accuracy of the examination was 85%. It was concluded that there was a correlation between fetal sex and plasma testosterone concentrations in pregnant mares. Prediction of fetal sex based on plasma concentrations of maternal testosterone can be performed in months 5 and 8 with 78.9% and 85% accuracy, respectively.

RESUMO: Os objetivos do estudo foram avaliar a correlação do sexo fetal com as concentrações plasmáticas de testosterona entre o 5° e o 8º mês de gestação na égua e verificar a aplicabilidade deste exame para a predição do sexo fetal. Amostras de sangue foram coletadas de 21 éguas, com intervalos de 30 dias, entre 150 e 240 dias de gestação. A testosterona plasmática foi determinada por radioimunoensaio e o sexo dos potros foi confirmado ao nascimento. Os valores de testosterona materna foram superiores nas éguas gestando fetos fêmeas aos cinco e oito meses (P< 0.05). Através da análise da curva ROC (receiver operating characteristic) foram determinados valores limites de 35,5 pg/mL e 40 pg/mL para o 5º e o 8° mês, respectivamente. Éguas com testosterona plasmática igual ou acima dos valores limites foram preditas como gestando fêmeas e éguas com testosterona plasmática abaixo dos valores limites foram preditas como gestando machos. Aos cinco meses, os valores preditivos para fetos machos e fêmeas foram 70% e 88,9%, respectivamente; as taxas de detecção foram 87,5% e 72,7% e a acurácia total do exame foi de 78,9%. Aos oito meses, os valores preditivos para fetos machos e fêmeas foram 80% e 90%, respectivamente; as taxas de detecção foram 88,9% e 81,8% e a acurácia total do exame foi de 85%. Conclui-se que houve correlação entre o sexo fetal e as concentrações de testosterona plasmática em éguas prenhes. A predição do sexo fetal baseada nas concentrações plasmáticas de testosterona materna pode ser realizada aos cinco e oito meses de gestação com 78,9% e 85% de acurácia, respectivamente.

Sêmen sexado através de citometria de fluxo e centrifugação por gradiente de concentração / Semen sexed using flow cytometry and concentration gradient centrifugation / Semen sexado a través de citometría de flujo y centrifugación por gradiente de concentración

Resumo O objetivo deste trabalho foi apresentar uma revisão completa e atualizada sobre a origem do sêmen sexuado, os requisitos e as técnicas de sexagem espermáticas. Nas últimas décadas, desenvolveram-se várias tecnologias na área da reprodução animal. O sêmen sexado é uma biotecnologia recente que ainda se encontra em fase de estudo e aperfeiçoamento em diversas etapas, devido a que o processo de sexagem causa estresse ao espermatozoide, e o deixa mais sensível ao processo de armazenamento; isto interfere diretamente na fertilidade. Esta tecnologia, que chegou ao Brasil em 2004, vem ganhando adeptos entre produtores que desejam produzir animais mais homogêneos para o sacrifício ou para a produção de leite. O uso do sêmen sexado tem sido difundido em muitos rebanhos do mundo, já que se apresenta como uma técnica com um direcionamento maior na seleção do sexo. Muitas técnicas têm sido utilizadas com a finalidade de buscar uma maior separação de espermatozoides portadores de cromossomas X e Y, com mínima agressão espermática. Desta forma, a utilização da sexagem espermática tem obtido resultados na aplicação de biotecnologias da reprodução assistida, e com isso tem elevado o lucro no melhoramento genético e tem otimizado a produtividade no sexo escolhido. Entretanto, ainda existem muitas limitações, principalmente referentes al tempo de exposição, o índice de aproveitamento e os resultados de índices de gestação em condições de campo. Por outro lado, a dose de sêmen sexado pode custar de duas a oito vezes o valor de uma convencional; da mesma forma, o seu uso avança no Brasil.

Abstract This study aimed to present a complete and updated review on the origin of sexed semen, as well as on the requirements and techniques of sperm sexing. In the last decades, several technologies were developed in the field of animal reproduction. Sexed semen is a recent biotechnology that is still under study and refinement in various stages, because the sexing process causes stress to the sperm, leaving it more sensitive to the storage process; this directly interferes with fertility. This technology, which arrived in Brazil in 2004, has been gaining support among producers who want to produce more homogeneous animals for slaughter or for dairy production. The use of sexed semen has been disseminated in many herds of the world, since it is a technique with better results in the selection of sex. Many techniques have been used in order to seek a greater separation of sperms carrying X and Y chromosomes, with minimal sperm aggression. In this way, the use of sperm sexing has obtained results in the application of assisted reproductive biotechnologies, which has increased the gain in genetic improvement and has optimized productivity in the chosen sex. In the meantime, there are still many limitations, mainly concerning exposure time, exploitation rate, and the results of pregnancy rates in field conditions. On the other hand, the dose of sexed semen can cost two to eight times the value of conventional semen; nevertheless, its use progresses in Brazil.

Resumen El objetivo de este trabajo fue presentar una revisión completa y actualizada sobre el origen del semen sexado, los requisitos y las técnicas de sexaje espermáticas. En las últimas décadas, se desarrollaron varias tecnologías en el área de la reproducción animal. El semen sexado es una biotecnología reciente que aún se encuentra en fase de estudio y perfeccionamiento en diversas etapas, debido a que el proceso de sexaje causa estrés al espermatozoide, y lo deja más sensible al proceso de almacenamiento; esto interfiere directamente en la fertilidad. Esta tecnología, que llegó a Brasil en 2004, viene ganando adeptos entre productores que desean producir animales más homogéneos para el sacrificio o para la producción lechera. El uso del semen sexado ha sido difundido en muchos rebaños del mundo, ya que se presenta como una técnica con un direccionamiento mayor en la selección del sexo. Muchas técnicas han sido utilizadas con el fin de buscar una mayor separación de espermatozoides portadores de cromosomas X y Y, con mínima agresión espermática. De esta forma, la utilización del sexaje espermático ha obtenido resultados en la aplicación de biotecnologías de la reproducción asistida, y con eso ha elevado la ganancia en el mejoramiento genético y ha optimizado la productividad en el sexo escogido. Entretanto, aún existen muchas limitaciones, principalmente referentes al tiempo de exposición, la taza de aprovechamiento y los resultados de tazas de gesta ción en condiciones de campo. Por otro lado, la dosis de semen sexado puede costar de dos a ocho veces el valor de una convencional; así mismo, su uso avanza en Brasil.

Assessment of swim-up and discontinuous density gradient in sperm sex preselection for bovine embryo production / Avaliação do swim-up e do gradiente descontinuo de densidade na pré-seleção do sexo de espermatozoides na produção de embriões bovinos

The purpose of this work was to associate the modified swim-up method with centrifugation in density gradient for the separation of X-bearing spermatozoa. Sperm viability and integrity were evaluated through the Trypan Blue/Giemsa staining method. Quality control of centrifuged spermatozoa was performed in in vitro produced embryos. The results were validated by the sex ratio of in vitro produced embryos using PCR by Y- specific sequences present in bovine male genomic DNA. After determining genetic sex of in vitro produced embryos, the results showed difference (P<0.05) in deviation of sex ratio when comparing the control group (45.2% females) with the other spermatozoa selection procedures (60.6% females) (P<0.05). The sperm selection methods are capable of selecting X-bearing spermatozoa without compromising the spermatozoa fertility (cleavage and blastocyst rates, 70% and 26%, respectively) and were considered relevant methods to be introduced in bovine in vitro produced embryo programs.

O objetivo do presente trabalho foi associar o método de swim-up modificado à centrifugação em gradiente de densidade para a separação de espermatozoides portadores do cromossomo X. A viabilidade e a integridade espermática foram avaliadas pelo método de coloração Azul de Tripan e Giemsa. O controle de qualidade dos espermatozoides centrifugados foi realizado por meio da produção in vitro de embriões bovinos. Os resultados foram validados pela técnica de PCR para verificar a proporção sexual dos embriões produzidos in vitro, com o uso de sequências Y especificas presente no DNA genômico de machos bovinos. Após determinar o sexo genético dos embriões produzidos in vitro, os resultados não mostraram diferença (P<0,05) no desvio da proporção do sexo quando comparou o grupo controle (45,2% de fêmeas) com os outros processos de seleção de espermatozoides (60,6% de fêmeas) (P<0,05). Os métodos de seleção de espermatozoides são capazes de selecionar espermatozoides portadores do cromossomo X sem comprometer a fertilidade, medida pelas taxas de clivagem e blastocisto de 70% e 26%, respectivamente, e foram considerados métodos de relevância para serem introduzidos nos programas de produção in vitro de embriões bovinos.

Morfometria e histologia das gônadas de machos e fêmeas recém-eclodidos de Podocnemis expansa e Podocnemis unifilis (Testudines, Podocnemididae) / Morphometry and histology of the gonads of males and females hatchlings of Podocnemis expansa and Podocnemis. unifilis (Testudines, Podocnemididae)

Considerando a importância da técnica histológica na sexagem de quelônios e os poucos trabalhos direcionados para esta técnica, é proposto neste estudo caracterizar morfometricamente e histologicamente as gônadas de P. expansa e P. unifilis. Todos os espécimes utilizados neste trabalho foram procedentes do rio Javaés, entorno do Parque Nacional do Araguaia, Estado do Tocantins, Brasil. Após estudo sob estereomicroscópio, foram coletadas as gônadas para o procedimento histológico de rotina. Foram analisadas 187 amostras de P. expansa, das quais 81,2% foram identificadas como fêmeas e 18,7% como machos; e 98 de P. unifilis, das quais 31,6% eram fêmeas e 68,4% machos. Não foram verificadas diferenças microscópicas relevantes na sexagem entre estas espécies. Os critérios utilizados no diagnóstico microscópico foram principalmente a morfologia das gônadas, a presença do apêndice no oviduto remanescente, a morfologia do oviduto e as características das células de revestimento dos folículos e túbulos seminíferos. Quando comparadas as medidas biométricas dos ovários e testículos, somente foram observadas diferenças para a largura.

Considering the importance of the histological sexing technique of turtles and the few works directed to this objective, it was proposed in this study to morphometrically and histologically characterize the gonads of P. unifilis and P. expansa. All specimens used in this work originated in the Javaés river, around the Araguaia National Park, Tocantins State, Brazil. Following a study under a stereoscope, the gonads were collected for the routine histological procedure. A total of 187 samples of P. expansa were analyzed, of which 81.2% were identified as female and 18.7% as male; as well as 98 P. unifilis samples, of which 31.6% were female and 68.4% males. No relevant microscopic differences were verified in the sexing between these species. The criteria used in the microscopically diagnosis were primarily gonad morphology, presence of the appendix in the remaining oviduct, oviduct morphology and the characteristics of covering cells of the follicles and somniferous tubules. When the measurements of the ovaries and testicles were compared, only differences in width were observed.

Validação comparativa utilizando PCR quantitativo em tempo real (qPCR) e PCR convencional de sêmen bovino centrifugado em gradiente de densidade contínuo / Comparative validation using quantitative real-time PCR (qPCR) and conventional PCR of bovine semen centrifuged in continuous density gradient

The objective of the present study was to determine the sperm enrichment with X-bearing spermatozoa, after one centrifugation in a Percoll or OptiPrep continuous density gradient, using quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) of sperm DNA and resultant in vitro-produced bovine embryos by PCR. Frozen/thawed sperm was layered on density gradients and the tubes were centrifuged. Supernatants were gently aspirated and the sperm recovered from the bottom of the tubes. Cleavage and blastocyst rates were determined through in vitro production of embryos and PCR was performed to identify the embryos' genetic sex. A difference in blastocyst rate was found in the Percoll treatment compared to OptiPrep (P<0.05). The percentage of female embryos in the Percoll and OptiPrep groups was 62.0 percent and 47.1 percent, respectively. These results were confirmed by qPCR of spermatozoa DNA and underestimation was seen only in the Percoll group. It was possible to sexing sperm using simple approach.

O objetivo do presente estudo foi determinar o enriquecimento de espermatozoides portadores do cromossomo X após a centrifugação em gradiente de densidade contínuo de Percoll ou OptiPrep, utilizando reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) do DNA do espermatozoide e dos embriões bovinos produzidos in vitro resultantes pela PCR convencional. Espermatozoides descongelado foram depositados em gradientes de densidade e os tubos foram centrifugados. Os sobrenadantes foram gentilmente aspirados e os espermatozoides recuperados do fundo dos tubos. As taxas de clivagem e de blastocisto foram determinadas pela produção in vitro de embriões e a PCR foi realizada para a identificação genética do sexo dos embriões. Verificou-se diferença na taxa de blastocistos entre os grupos Percoll e OptiPrep (P<0,05). A porcentagem de embriões de fêmeas nos grupos Percoll e OptiPrep foi de 62,0 por cento e 47,1 por cento, respectivamente. Estes resultados foram confirmados pela qPCR do DNA de espermatozoides e uma subestimação foi observada no grupo do gradiente de densidade de Percoll. Foi possível a sexagem de espermatozoides utilizando uma metodologia simples.

Pregnancy diagnosis, fetal quantification and gender estimation by ultra-sonography in ewes / Diagnóstico de gestação, quantificação e sexagem fetal por ultra-sonografia em ovelhas

The objective of this experiment was to evaluate the accuracy of gestation, fetal sexing and quantification diagnoses in ewes. Pregnancy and fetal quantification were diagnosed in 105 ewes at 35 days of pregnancy. For the fetal gender diagnosis sexing diagnose 55 ewes between 49 and 59 days of pregnancy were used. All exams were recorded on DVD for posterior analysis. After birth, lamb sex was recorded to determine fetal sexing precision. Data were analyzed by chisquare ( 2) or Fisher’s test, with a significance of 0.05. One hundred percent of pregnancy ultrasound diagnoses were correct. As for the fetal quantification diagnoses, there was an error of 12%. It was possible to diagnose the fetal sex in 87% of the 69 examined fetuses, and 90% of these were estimated correctly. The realtime ultrasound diagnoses were not different from the recorded DVD image diagnoses. Therefore, pregnancy diagnosis accuracy may reach 100%, differing from fetal gender estimation and quantification, which are dependent upon other variables such as fetal genderand examiner experience.

O objetivo deste experimento foi avaliar a acurácia do diagnóstico de gestação, quantificação e sexagem fetal em ovelhas. Foram realizados o diagnóstico de gestação e a quantificação fetal em 105 ovelhas aos 35 dias de gestação. Para o diagnóstico da sexagem fetal foram utilizadas 55 ovelhas com período de gestação entre 49 e 59 dias. As imagens de todos os exames foram gravadas em DVD para permitir posterior análise. Após o nascimento dos cordeiros, os respectivos sexos foram observados para determinar a precisão do exame de sexagem fetal. Os dados foram analisados pelo teste Qui- quadrado ( 2) ou Teste de Fisher, com nível de significância de 5%. Observou-se 100% de acerto no diagnóstico de gestação pela ultra-sonografia. Quanto ao diagnóstico de quantificação fetal, houve 12% de erro. Foi possível diagnosticar o sexo fetal em 87% dos fetos e destes, 90% estavam corretos. Os diagnósticos em tempo real não foram significativamente diferentes dos diagnósticos feitos após a observação de imagens gravadas em DVD. Portanto, a acurácia do diagnóstico de gestação pode alcançar 100%, diferente da quantificação e sexagem fetal, que dependem de outras variáveis como tipo de gestação e experiência do operador.

Falha na sexagem por inibição do desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro com anticorpos anti H-Y / Failure of sexing by developmental arrest of bovine embryos in vitro produced with H-Y antisera

Embriões bovinos produzidos in vitro, em estádio de mórula, foram cultivados em meio contendo anticorpos anti H-Y de alto título proveniente de ratos por 24h e, após este tempo, classificados em dois grupos: 1) embriões inibidos em estádio de mórula (classificados como machos) e 2) embriões que se desenvolveram e formaram a blastocele (classificados como fêmeas). O sexo de 311 embriões, distribuídos em três grupos de concentração dos anticorpos, 3 por cento, 5 por cento ou 7 por cento, foi identificado pela reação em cadeia da polimerase. Não houve desvio da proporção entre machos e fêmeas (P>0,05) nos grupos em que se utilizaram os anticorpos anti H-Y, quando comparadas ao grupo-controle, sem adição de anticorpos anti H-Y. Diferentemente dos resultados obtidos utilizando-se embriões bovinos produzidos in vivo, a sexagem com anticorpos anti H-Y de alto título em embriões produzidos in vitro não propiciou sucesso.

In vitro produced bovine embryos at morula stage were cultured in medium containing high titer of rat H-Y antisera for 24h. The embryos were classified in two groups: 1) embryos arrested at morula stage (classified as males); and 2) embryos that developed and formed a blastocoele (classified as female). The sex of 311 embryos, divided in three groups of concentration of H-Y antisera, 3 percent, 5 percent or 7 percent, was identified by polimerase chain reaction. The results showed no difference (P>0.05) on sexual deviation in groups in which the H-Y antisera was added, in relation to control group, in which no H-Y antisera was added. In contrast with results obtained with in vivo produced bovine embryos, the sexing of in vitro produced bovine embryos with high H-Y antisera titer did not succed.

Dimorfismo sexual do gorgulho-da-goiaba Conotrachelus psidii Marshall (Coleoptera: Curculionidae) / Sexual dimorphism of guava weevil Conotrachelus psidii Marshall (Coleoptera: Curculionidae)

Este trabalho teve como objetivo determinar diferenças que permitam identificar o sexo de adultos de Conotrachelus psidii Marshall, 1922. Gorgulhos coletados em um pomar comercial de goiaba foram individualizados em caixas e mantidos em laboratório. Diariamente, dez gorgulhos eram agrupados e seu comportamento observado. Durante o acasalamento, os machos e as fêmeas eram identificados. Cinqüenta gorgulhos de cada sexo foram sacrificados e observados sob microscópio estereoscópico. Foram examinadas a inserção da antena no rostro e a distribuição de pilosidade na superfície do tórax e abdome. Também, foi medido o comprimento e a largura do corpo, pronoto, último esternito abdominal e rostro. Do ponto de vista comportamental, machos emitem sons por estridulação enquanto que as fêmeas não. A largura do corpo, do pronoto e o comprimento do corpo e do rostro nas fêmeas foram maiores, enquanto que a largura do último esternito abdominal foi menor. Três outras diferenças morfológicas são visíveis a olho nu: 1) A região anterior do pronoto das fêmeas possui pilosidade reduzida ou ausente enquanto que nos machos é abundante; 2) o último tergito nas fêmeas fica recoberto pelo penúltimo enquanto que nos machos é parcialmente visível; 3) o primeiro esternito abdominal nas fêmeas é mais proeminente, convexo e com pilosidade reduzida ou ausente. Nos machos esse segmento é ligeiramente côncavo e com pilosidade em toda a superfície. As diferenças entre machos e fêmeas encontradas neste trabalho permitem, sem danificar os insetos nem alterar seu comportamento, uma sexagem eficiente do gorgulho-da-goiaba.

We investigate structural and behavioral differences between male and female adults of guava weevil, Conotrachelus psidii Marshall, 1922 to help in sex determination. Weevils collected from a commercial guava orchard were individually caged and maintained under laboratory conditions. Every day ten individuals were grouped and their behavior was observed. During mating the males and females were identified. Fifty weevils of each sex were killed and they were observed with stereoscopic microscope. The antenna insertion on the rostrum and hair on the thorax and abdomen surfaces were examined. Length and width of body, pronotum, last abdominal sternite and rostrum were also taken. Behaviorally, the male weevils produce audible sound by stridulation of abdomen while females do not. In the females, the body and pronotum width and body a rostrum length were higher than in the males, but the last abdominal sternite was smaller. Three other structural differences were visible with the naked eye: 1) the anterior region of pronotum have scarce hair or have not in the females and hair is dense in the males; 2) the last tergite of females is hidden by the penultimate tergite whereas in the males is visible; 3) the first abdominal sternite of females is more prominent, very convex and without or with little bristle. In the males it is slightly concave and with abundant hair. The male-female differences found in this work allow, without hurt or change insect behavior, an efficient sex determination of guava weevil.