RESUMO
This protocol describes an optimized high-throughput procedure for generating double deletion mutants in Schizosaccharomyces pombe using the colony replicating robot ROTOR HDA and the PEM (pombe epistasis mapper) system. The method is based on generating high-density colony arrays (1536 colonies per agar plate) and passaging them through a series of antidiploid and mating-type selection (ADS-MTS) and double-mutant selection (DMS) steps. Detailed program parameters for each individual replication step are provided. Using this procedure, batches of 25 or more screens can be routinely performed.
Assuntos
Mapeamento Cromossômico/instrumentação , Mapeamento Cromossômico/métodos , Epistasia Genética , Genes Fúngicos , Genética Microbiana/instrumentação , Genética Microbiana/métodos , Schizosaccharomyces/genética , Deleção de Genes , Ensaios de Triagem em Larga Escala/instrumentação , Ensaios de Triagem em Larga Escala/métodos , Robótica/instrumentação , Robótica/métodos , Schizosaccharomyces/crescimento & desenvolvimento , Seleção GenéticaRESUMO
In laboratories in which a colony-replicating robot is not available, manual replication provides a good, low-cost alternative for genetic interaction screening using the Pombe Epistasis Mapper (PEM) system. The protocol presented here describes the minimum number of steps required to identify genetic interactions. First, a query deletion is introduced to a library of deletion mutants by mating. Through a series of subsequent selection steps, single and double mutants are isolated and analyzed.
Assuntos
Mapeamento Cromossômico/instrumentação , Mapeamento Cromossômico/métodos , Epistasia Genética , Genes Fúngicos , Genética Microbiana/instrumentação , Genética Microbiana/métodos , Schizosaccharomyces/genética , Mutação , Seleção GenéticaRESUMO
Genetic transformation of filamentous fungi is an essential tool in many areas such as biotechnology, medicine, phytopathology and genetics. However, available protocols to transform fungi are inefficient, laborious and have low reproducibility. We report the use of underwater shock waves as a novel method to transform filamentous fungi. An experimental piezoelectric shock wave generator was designed to expose fungal conidia to heterologous DNA. The device was successfully tested in Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Trichoderma reesei and Phanerochaete chrysosporium. The transformation frequency per number of conidia was between two and four orders of magnitude higher in comparison to previously published methods. For example, the frequency of transformation in A. niger was improved up to 5400-fold as compared with Agrobacterium protocols. Transformation was verified by expression of the green fluorescent protein, PCR and Southern blot. Our method offers new possibilities for fast, easy and efficient genetic manipulation of diverse fungal species.
Assuntos
Fungos/genética , Técnicas de Transferência de Genes/instrumentação , Genética Microbiana/métodos , Biologia Molecular/métodos , Estresse Mecânico , Transformação Genética , Genética Microbiana/instrumentação , Biologia Molecular/instrumentação , Esporos Fúngicos/genéticaAssuntos
Genética Microbiana/métodos , Genômica/métodos , Análise de Sequência de DNA/métodos , Análise de Célula Única/métodos , Genética Microbiana/instrumentação , Genética Microbiana/tendências , Genômica/instrumentação , Genômica/tendências , Análise de Sequência de DNA/instrumentação , Análise de Sequência de DNA/tendências , Análise de Célula Única/instrumentação , Análise de Célula Única/tendênciasRESUMO
UNLABELLED: In order to understand and interpret phylogenetic and functional relationships between multiple prokaryotic species, qualitative and quantitative data must be correlated and displayed. GECO allows linear visualization of multiple genomes using a client/server based approach by dynamically creating .png- or .pdf-formatted images. It is able to display ortholog relations calculated using BLASTCLUST by color coding ortholog representations. Irregularities on the genomic level can be identified by anomalous G/C composition. Thus, this software will enable researchers to detect horizontally transferred genes, pseudogenes and insertions/deletions in related microbial genomes. AVAILABILITY: http://bioinfo.mikrobio.med.uni-giessen.de/geco2/GecoMainServlet
Assuntos
Apresentação de Dados , Genes Bacterianos , Genética Microbiana/instrumentação , Software , Algoritmos , Evolução Molecular , Armazenamento e Recuperação da Informação , Especificidade da Espécie , Interface Usuário-ComputadorAssuntos
Anti-Infecciosos/farmacologia , Genética Microbiana , Genômica , Amidoidrolases/efeitos adversos , Amidoidrolases/química , Amidoidrolases/genética , Sistemas de Liberação de Medicamentos , Desenho de Fármacos , Inibidores Enzimáticos/farmacologia , Genética Microbiana/instrumentação , Genética Microbiana/métodos , Genômica/instrumentação , Genômica/métodos , Metionina tRNA Ligase/antagonistas & inibidores , Metionina tRNA Ligase/genética , Análise de Sequência com Séries de OligonucleotídeosAssuntos
Estudos Epidemiológicos , Genética Microbiana/métodos , Genômica , Análise de Sequência com Séries de Oligonucleotídeos/métodos , Técnicas de Laboratório Clínico , Sondas de DNA/química , Sondas de DNA/genética , Genética Microbiana/instrumentação , Humanos , Análise de Sequência com Séries de Oligonucleotídeos/instrumentaçãoRESUMO
FindGDPs is a program that uses a greedy algorithm to quickly identify a set of genome-directed primers that specifically anneal to all of the open reading frames ina genome and that do not exhibit full-length complementarity to the members of another user-supplied set of nucleotide sequences.
