Influencia de la fase preanalítica en la cuantificación de la carga viral: aprendiendo de la experiencia / Influence of pre-analytical phase in viral load quantification: learning with the experience

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Avaliação de terapias imunossupressoras em transplantes renais com uma abordagem metabolômica / Assessment of immunosuppressive therapies with a metabolomic approach

O aprimoramento das técnicas analíticas viabilizou a metabolômica, uma área da ciência que busca compreender, de forma comparativa, os metabólitos envolvidos nas vias bioquímicas. A metabolômica está inserida no contexto das "ômicas", que teve início na "Era Genômica", a qual permitiu a identificação de diversos genes. Em seguida, o interesse dos pesquisadores centrou no estudo dos metabólitos (metabolômica) mostrando ser uma ferramenta valiosa na pesquisa do transplante renal, que exige um tratamento medicamentoso por meio de imunossupressores. A combinação destes imunossupressores pode minimizar a rejeição do órgão transplantado, reforçando a necessidade de um estudo metabolômico, a fim de avaliar e comparar as mudanças ocorridas após o transplante em nível molecular, melhorando o conhecimento sobre a influência destes regimes e dando subsídios sobre prognósticos possíveis na área de transplante renal. Nesta tese foram avaliadas 2 terapias: Everolimo/ Prednisona/Tacrolimo (grupo 1) e Micofenolato mofetil/Prednisona/Tacrolimo (grupo 2) a partir de uma abordagem untargeted. No presente trabalho foram coletadas amostras de urina de pacientes ao longo de 6 meses. Foi necessário determinar a melhor condição para análise das amostras de urina dos pacientes. Desta forma, foram realizados estudos sobre alguns parâmetros que impactam no preparo de amostra abordando a influência da urease, tipos e proporção de solventes para precipitação de proteína, seleção do melhor agente derivatizante e tratamento de dados. A avaliação da medida de qualidade dos tratamentos com urease foi feita a partir do desvio padrão relativo (RSD) dos valores de intensidade de pico. A concentração de 10 mg mL-1 apresentou o melhor resultado. O estudo mostrou também que o teor de ureia na urina pode influenciar na identificação dos compostos. O número de compostos identificados foi menor quando a urina não foi tratada com urease, com aproximadamente 10 compostos a menos em relação à amostra tratada com a enzima, na mesma concentração de ureia adicionada. Dos solventes orgânicos testados para precipitação de proteínas nas amostras de urina, o isopropanol mostrou ser o solvente mais adequado na proporção 1:6 urina:solvente (v/v), utilizando-se 100 µL de urina. Foram testados dois protocolos de derivatização para análises por GC-MS: metoximação e sililação utilizando BSTFA e cloroformiato de metila. A comparação mostrou que o procedimento por BSTFA, com 40 metabólitos identificados, foi superior ao cloroformiato de metila, com 13 compostos identificados. No tratamento de dados com o software XCMS, os seguintes parâmetros foram avaliados: largura a meia altura do pico (fwhm), largura da banda (bw) e threshold (sntresh). Para avaliar a melhor combinação destes parâmetros, foi feita uma variação univariada destes valores. A qualidade do resultado de cada combinação foi monitorada pelos valores gerados de número de missing values, quantidade de picos com RSD <15% e número de valores duplicados. Os valores ótimos foram obtidos para a combinação: fwhm=4, bw=2 e threshold=5. A abordagem do estudo dos dois grupos de pacientes baseou-se inicialmente na comparação entre o dia 7 da terapia com os demais períodos (dia 14, mês 1, mês 3 e mês 6) e posteriormente avaliou-se a evolução temporal. A partir do mês 3 os valores de correlação e predição dos modelos de PLS-DA são melhores e já é eficaz na diferenciação entre os dois grupos. Foram observadas perturbações no metabolismo de carboidratos em ambos os grupos, como açúcares, glicerol e N-acetil-D-manosamina. No grupo 1, foram observados metabólitos discriminantes da classe dos poliois e das vias do ciclo do ácido cítrico e degradação de xenobióticos, enquanto que, no grupo 2, foi observada alteração do hidroxibutirato, um corpo cetônico. Neste grupo, foi observado também um aumento do ácido hipúrico, ácido acetamido butírico, ácido benzoico, entre outros. Nesta tese foi possível demonstrar que a metabolômica é uma ferramenta importante para comparar metabólitos discriminantes entre dois regimes imunossupressores, sendo um estudo piloto que visa fornecer subsídios para avaliação da influência destas terapias no prognóstico de transplante renal

The improvement of analytical techniques enabled the emergence of metabolomics, which aims to compare the metabolites involved in biochemical pathways, in certain biological conditions. Metabolomics is inserted in the "omics" context, which began in the "Genomic Age", and allowed the identification of several genes. After that, the researchers focused on the study of metabolites. Among several applications, metabolomics can be a valuable tool in renal transplant research, which requires a drug treatment through immunosuppressants. The combination of these immunosuppressants can minimize toxicity and rejection of the transplanted organ, reinforcing the need for a metabolomic study, in order to evaluate and compare changes after transplantation at the molecular level, improving knowledge about the influence of these regimens and giving subsidies on prognosis in the area of renal transplantation. In this thesis two immunosuppressive therapies were evaluated by an untargeted approach: Everolimus/Prednisone/Tacrolimus (group 1) and Mycophenolate mofetil/Prednisone/Tacrolimus (group 2). In this study, urine samples were collected from patients over 6 months. It was necessary to determine the best condition for analysis of patients' urine samples. Thus, studies were carried out on some parameters that impact on sample preparation, evaluating the influence of urease, types and proportion of solvents for protein precipitation, selection of the best derivatizing agent, and data treatment. The evaluation of the quality measure of the urease treatments was made from the relative standard deviation (RSD) of the peak intensity values. The concentration of 10 mg mL-1 presented the best result. The study also showed that urine urea content may influence the identification of the compounds. The number of identified compounds was lower when urine was not treated with urease, with approximately 10 compounds less than the enzyme-treated sample, at the same concentration of urea added. In the evaluation of the organic solvents tested for protein precipitation in the urine samples, isopropanol was the most suitable solvent in the ratio 1: 6 urine:solvent (v/v), using 100 µL of urine. Two derivatization protocols were tested for GC-MS analysis: metoximation and silylation with BSTFA and methyl chloroformate. The comparison between the two derivatization protocols showed that the BSTFA procedure, with 40 identified metabolites, was superior to methyl chloroformate with 13 compounds identified. In data processing with the XCMS software, the following parameters were evaluated: full width at half maximum of the peak (fwhm), bandwidth (bw) and threshold (sntresh). To evaluate the best combination of these parameters, a univariate variation of these values was made. The quality of the result of each combination was monitored by the number of missing values, number of peaks with RSD <15%, and number of duplicate values. The optimal values were obtained for the combination: fwhm=4, bw=2 and threshold =5. The study of the two groups of patients was initially based on the comparison between day 7 of the therapy with the other periods (day 14, month 1, month 3 and month 6) and later the temporal evolution was evaluated. From month 3 the values of correlation and prediction of the PLS-DA models are better and already effective in the differentiation between the two groups. Disorders in carbohydrate metabolism were observed in both groups with sugars and glycerol and N-acetyl-D-mannosamine as discriminant metabolites. In group 1, discriminant metabolites of the class of polyols and citric acid cycle pathways and degradation of xenobiotics were observed, and in group 2 alteration of hydroxybutyrate, a ketone body, was observed. In this group an increase of hippuric acid, acetamido butyric acid, benzoic acid, among others, was also observed. In this thesis it was possible to demonstrate that metabolomics is an important tool to compare discriminant metabolites between two immunosuppressive regimens, being a pilot study that aims to provide future subsidies to evaluate the influence of these therapies on the renal transplant prognosis

Vitrificación de embriones y transferencia en ciclo posterior como estrategia segura y eficiente en pacientes altas respondedoras / No disponible

OBJETIVO: El objetivo de este estudio retrospectivo fue comparar el impacto de dos estrategias de maduración ovocitaria en un grupo de pacientes alta respondedoras con riesgo de hiperestimulación ovárica. MATERIAL Y MÉTODOS: La pauta de estimulación empleada, basada en el empleo concomitante de la hormona folículo estimulante (FSHr) (75 IU) y la gonadotropina menopaúsica humana (hMG-HP) (75 IU), consistió en un protocolo corto con antagonistas de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH) en combinación con dos pautas de maduración ovocitaria: administración de un bolo de agonista de la GnRH (aGnRH) (n=37) seguida de la criopreservación de embriones y transferencia embrionaria en ciclo posterior o de gonadotropina coriónica humana (hCG) (n=49) y transferencia embrionaria en fresco. RESULTADOS: Los resultados obtenidos fueron comparables para la tasa de fecundación siendo significativamente superior en el grupo donde se administró el aGnRH como inductor de la ovulación (739/888 [83,2%] vs. 441/618 [71,3%], p < 0,05). No se obtuvieron diferencias significativas para las tasas de implantación (35/100 [35%] vs. 41/127 [32,3%]) o embarazo clínico (30/36 [83,3%] vs. 32/41 [78%]). CONCLUSIÓN: La estrategia conseguida al combinar la administración de un bolo de aGnRH con la vitrificación programada de embriones ofrece una alternativa segura y eficiente para evitar la hiperestimulación ovárica sin restar posibilidades de embarazo. La inducción de la maduración ovocitaria con agonistas de la GnRH en pacientes con alta respuesta consigue la obtención de un mayor número de embriones para realizar una transferencia embrionaria sin comprometer el estado clínico de la paciente ni los resultados del ciclo

OBJECTIVE: The aim of this retrospective study was to compare the impact of two strategies for oocyte maturation in a group of high responders at risk of ovarian hyperstimulation. MATERIALS AND METHODS: The stimulation based on a concomitant administration of recombinant follicle stimulating hormone (rFSH) (75 UI) and human menopausal gonadotrophin (hMG-HP) (75 UI), was arranged as a gonadotrophin releasing hormone (GnRH) antagonist short protocol combined with two different approaches of final oocyte maturation: GnRH agonist triggering (aGnRH) and embryo transfer in a later non stimulated cycle (n=37) or human chorionic gonadotropin (hCG) followed by fresh embryo transfer (n=49). RESULTS: The fertilization rate resulted significantly higher when aGnRH was used as ovulation inducer (739/888 [83.2%] vs. 441/618 [71.3%], p <0.05). No differences between the subgroups were detected in terms of cumulative implantation (35/100 [35%] vs. 41/127 [32.3%]) and clinical pregnancy rates (30/36 [83.3%] vs. 32/41 [78%]). CONCLUSION: The strategy achieved by combining the administration of a single bolus of aGnRH with elective vitrification of all embryos offers a safe and efficient alternative to avoid the risk of ovarian hyperstimulation without decreasing the chances of pregnancy. The induction of oocyte maturation with GnRH agonists in high responders provides a high number of embryos to be transferred without compromising the clinical condition of the patient and reproductive outcome