Activación química de ovocitos de alpaca vitrificados después de la maduración in vitro / Chemical activation of alpaca oocytes vitrified after in vitro maturation

RESUMEN

Se evaluó la viabilidad posdescongelamiento de ovocitos de alpaca vitrificados luego de la maduración in vitro. Los ovocitos fueron recuperados de ovarios obtenidos en el camal Municipal de Huancavelica, Perú, madurados in vitro por 24-25 h en una cámara modular con 5% de O2, 5% de CO2 y 90% de N2 en medio TCM-199 suplementado con Piruvato de Na, HEPES, sulfato de gentamicina, FSH, estradiol 17-beta y suero fetal bovino. Los ovocitos fueron separados de las células de la granulosa con hialuronidasa al 0.1% y distribuidos en tres tratamientos T1 (n=107), ovocitos expuestos a las soluciones crioprotectoras y vitrificados; T2 (n=121), ovocitos expuestos a las soluciones crioprotectoras no vitrificados (control de toxicidad de los crioprotectantes); T3 (n=232), grupo control de ovocitos no expuestos a las soluciones vitrificantes. Los ovocitos fueron vitrificados en microgotas sobre un papel de aluminio flotando en nitrógeno líquido, utilizando una solución de equilibrio con 4% de etilenglicol y una solución de vitrificación con 35% de etilenglicol, 5% de polivinilpirrolidona y 0.4 M de trehalosa. Las microgotas vitrificadas se almacenaron en nitrógeno líquido y fueron descongeladas 1-4 después. Todos los ovocitos fueron cultivados en SOF-HEPES con 5 uM de ionomicina de Ca por 4 min a temperatura ambiente y luego cultivados por 3 h en 6-DMAP a 38.5 °C en una atmósfera húmeda con 5% de O2, 5% de CO2 y 90% de N2. Luego se cultivaron por 8 d en medio SOF-IVC. Se encontró 58.4, 68.7 y 97.3% de ovocitos morfológicamente normales para T1, T2 y T3, respectivamente. Las tasas de segmentación fueron de 39.9, 49.5 y 62.3%, y las tasas de blastocistos fueron de 0, 0 y 9.2% para T1, T2 y T3, respectivamente. Los resultados demuestran que los ovocitos de alpaca pueden ser vitrificados con el método de superficie sólida y que son viables morfológicamente y fisiológicamente posdescongelamiento.

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the viability of vitrified/thawed alpaca oocytes after in vitro maturation. Alpaca oocytes were retrieved from ovaries obtained in theslaughterhouse of Huancavelica, Peru and matured in vitro for 24-25 h in a modular chamber with 5% O2, 5% CO2 and 90% N2 in TCM-199 medium supplemented with sodium pyruvate, HEPES, gentamycin sulphate, FSH, estradiol 17-beta and fetal calf serum. Then, oocytes were fully denuded of cumulus cells with 0.1% hyaluronidase and assigned to three treatments T1 (n=107), oocytes exposed to cryoprotectans and vitrified; T2 (n=121), oocytes exposed to cryoprotectans without vitrification; and T3 (n=232), control group of oocytes not exposed to vitrification solutions. Alpaca oocytes were vitrified in microdrops on a precooled aluminum foil floating in liquid nitrogen, using an equilibrium solution with 4% ethylene glycol and a vitrification solution with 35% ethylene glycol, 5% polyvinyl-pyrrolidone and 0.4 M trehalose. The vitrified microdrops were stored in liquid nitrogen and were thawed 1-4 d later. All oocytes were cultured on SOF-HEPES with 5 umM Ca ionomycin by 4 min at room temperature followed by 3 h incubation in 6-DMAP at 38.5 ºC in a 5% O2, 5% CO2 and 90% N2 in humidified atmosphere. Subsequently, were cultivated on mSOF medium during 8 days. The rates of oocytes survival were 58.4, 68.7 and 97.3% in T1, T2 and T2 respectively. The rates of cleavage were 39.9, 49.5 and 62.3% and rates of development to blastocysts were 0, 0 and 9.2% in T1, T2 and T3 respectively. The results showed that alpaca oocytes were morphologically and physiologically viable after vitrification by solid surface method.