A relação entre a expressão de sintases do óxido nítrico por células de Reed-Sternberg, apoptose e infecção pelo vírus de Epstein-Barr no linfoma de Hodgkin / The relationship between nitric oxide synthases expression in classical Hodgkin lymphoma, apoptosis-related proteins and Epstein-Barr virus expression

RESUMO

Introdução. O linfoma de Hodgkin (LH) é uma neoplasia caracterizada por uma minoria de elementos neoplásicos, chamados de células de Reed-Sternberg (CRS) e suas variantes, e uma mistura de células inflamatórias que infiltram a massa tumoral, incluindo linfócitos, eosinófilos, plasmócitos, histiócitos e fibroblastos. Estudos clínicos e biológicos nos últimos 20 anos demonstraram o LH é verdadeiramente um linfoma, constituído por duas entidades distintas o LH forma predominância linfocitária nodular (LHPLN) e o LH Clássico (LHC). Além disso, forneceram evidências de que as CRS são derivadas de células B do centro germinativo que sofreram mutações defeituosas ("crippling" mutations) de seus genes de imunoglobulina, tornando-os não funcionais. Ao contrário de linfócitos normais, que entram em apoptose por não produzirem imunoglobulina ou por produzir imungolobulinas com baixa afinidade antigênica, as CRS, por mecanismos ainda não completamente elucidados, são capazes de escapar deste processo de morte celular programada. Diversos genes ligados à regulação da apoptose, como os genes da família bcl-2, fas, fasL, c-FLIP, NFkappaB, têm sido investigados no LH, alguns dos quais parecem ter influência na evolução clínica dos pacientes. O papel desempenhado pelo vírus de Epstein-Barr (EBV) no bloqueio da apoptose no LH também tem sido intensamente estudado. O óxido nítrico (ON) é uma molécula diatômica cuja participação na regulação de numerosos processos que governam a carcinogênese, como o estímulo à profileração, ocorrência de mutações, bloqueio de apoptose, indução da angiogênese e ocorrência de metástases, tem sido intensamente estudada. O ON é produzido por uma família de enzimas denominadas sintases do óxido nítrico (NOS). Um aumento da expressão dos genes que codificam NOS e da produção de ON tem sido demonstrado em diversas neoplasias humanas, incluindo cânceres de mama, estômago, cólon, bexiga, próstata, pulmão e neoplasias hematopoiéticas. Objetivos. O objetivo deste estudo é analisar a expressão das sintases do óxido nítrico (NOS1, NOS2), da nitrotirosina (evidência indireta da produção de óxido nítrico) e de proteínas associadas a apoptose (bcl-2, bax, p53, fas e fasL) no LHC, para testar a hipótese de que a produção de NOS e ON pelas CRS está envolvida na regulação defeituosa da apoptose nesta neoplasia. Foi estudada ainda a possível correlação destas moléculas com a infecção pelo EBV observada no LHC. Finalmente, pesquisou-se a capacidade das células L&H do LHPLN de produzir NOS e ON. Material e métodos. Blocos de parafina contendo material conservado em formalina de 238 casos de LHC foram selecionados do arquivo do Departamento de Patologia do Centro de Tratamento e Pesquisa Hospital do Câncer A C Camargo, São Paulo, Brasil, no período de 1980 a 2000. Foram excluídos casos com material insuficiente para realização do estudo, biópsias de recidiva e casos HIV-positivos. Após revisão histopatológica e, quando necessário, imunoistoquímica, foram submetidos a estudo imunoistoquímico utilizando anticorpos para NOS1, NOS2, nitrotirosina, bcl-2, bax, p53, fas, fasL e LMP1. Foi realizada ainda hibridização in situ com sonda contra o transcrito EBER-1 do vírus de Epstein-Barr. As lâminas foram analisadas e os resultados submetidos à análise estatística. Foram selecionados ainda 7 casos de LHPLN, que, após confirmação diagnóstica, foram submetidos a estudo imunoistoquímico utilizando anticorpos para NOS1, NOS2 e nitrotirosina. Resultados. Dos 238 casos iniciais de LHC, 171 foram selecionados para análise. A expressão de NOS1 e de NOS2 foi observada em 42.1% e 55% dos casos, respectivamente. A expressão de nitrotirosina foi observada em 18.7% dos casos. As expressões de bcl-2, bax, p53, fas, fasL e LMP1 foram observadas, respectivamente, em 35.1%, 44.4%, 44.4%, 93,6%, 5.8% e 49.7% dos casos. O transcrito EBER-1 foi detectado em 46.8% dos casos. Foram observadas associações estatisticamente significativas entre fas e sexo masculino (p=0.032), EBV (LMP-1 e EBER) e sexo masculino (p<0.0001), EBV (LMP-1 e EBER) e subtipo histológico celularidade mista (p<0.0001), EBV e estadios avançados (LMP-1, p=0.0459; EBER, p=0.011), EBV (EBER) e sintomas B (p=0.0481), bax e p53 (p=0.036), bax e fasL (p=0.046), NOS1 e p53 (p=0.006), bax e NOS2 (p=0.022); e entre bcl-2 e NOS2 (p=0.034). Correlação inversa foi observada entre EBV (LMP-1) e NOS2 (p=0.018) , e entre EBV e bcl-2 (LMP-1, p=0.002; EBER, p=0.006). Observou-se ainda uma diminuição da sobrevida global associada à forte expressão de NOS2 (p=0.0098). A forte expressão de NOS2 pelas CRS também foi fator associado a um pior prognóstico em casos tratados com o esquema quimioterápico MOPP/ABVD (p=0.0003). Com relação ao LHPLN, observou-se expressão de NOS1 e NOS2 pelas células L&H em 42.9% e 71.4% dos casos, respectivamente. Não se observou a expressão de nitrotirosina. Conclusões. Os resultados do presente estudo demonstraram a capacidade das CRS de expressarem NOS e produzirem ON, assim como de expressarem genes produtores de proteínas reguladoras do ciclo celular. As correlações observadas entre NOS e as proteínas associadas a apoptose sugerem o envolvimento das NOS e do ON no controle deste processo. Observou-se ainda que a expressão de NOS2 está associada a uma menor sobrevida global nos casos de LHC. Com relação ao LHPLN, demonstrou-se que as células L&H são capazes de produzir NOS1 e NOS2. Não foi possível demonstrar, entretanto, a produção de nitrotirosina..

ABSTRACT

Background. Hodgkin' s lymphoma (HL) is a neoplasm composed by a minority of neoplastic cells, named Hodgkin and Reed-Stemberg (H-RS) cells, set in an inflammatory background consisting of lymphocytes, eosinophils, neutrophils, histiocytes, plasma cells and fibroblasts. Clinicai and biological studies over the past 20 years have concluded that HL is indeed a lymphoma, divided into 2 distinct entities Nodular lymphocyte predominant Hodgkin lymphoma (NLPHL) and classical Hodgkin lymphoma (CHL ). Furthermore, they gave evidence that H-RS cells are derived from germinai center B cells with rearranged immunoglobulin genes bearing crippling mutations. Unlike normal B lymphocytes, which suffer apoptosis when failing to produce immunoglobulins, or producing low-antigenic affinity immunoglobulins, H-RS cells, by tnechanisms not fully understood, are capable of escaping apoptotic cell death. Many apoptotic regulators, such as bcl-2 family members, fas, fasL, c-FLIP, and NFkappaB, have been investigated in HL, some of which appearing to influence the clinicai outcome o f HL patients. The role o f EBV in the resistance to apoptotic cell death o f H-RS cells has also been under study. Nitric oxide (NO) is a diatomic molecule involved in multiple steps of carcinogenesis, such as DNA mutations, proliferation, blockage of apoptosis and angiogenic stimulation. NO is produced by a family of enzymes known as the nitric oxide synthases (NOS). NOS gene overexpression and NO production have been observed in many human tumors from various sites such as the breast, stomach, colon, bladder, prostate, lung and the haematopoietic system. Objective. The purpose o f this study was to analyze the role o f NOS (NOS 1, NOS2) and apoptosis-associated proteins expression in HL, to test the hypothesis that NOS and NO production by H-RS cells are involved in the deffective apoptotic program of this neoplasm. We also investigated the role of EBV expression in HL on NOS expression and NO production. Finally, we investigated if L&H cells of NLPHL could produce NOS and NO. Material and methods. 238 retrospective cases of HL, diagnosed between 1980 and 2000, were retrieved from the archives o f the Departamento de Patologia do Centro de Pesquisa do Hospital do Câncer A C Camargo. Cases without enough formalin-fixed and paraffin-embedded tis sue to run the immunohistochemical (IH C) reactions, relapse biopsies and HIVassociated HL were excluded. Histological diagnosis was revised, with the use of immunostains when necessary. Immunostains with antibodies against NOS 1, NOS2, nitrotyrosine, bcl-2, bax, p53, fas, fasL and LMP1 were performed. Cases were also tested for EBV presence using in situ hybridization for EBV early RNAs (EBER). We also selected 7 cases diagnosed as NLPHL, which were tested for NOS 1, NOS2 and nitrotyrosine expression. Results. A total o f 171 cases from the original 23 8 cases collected were available for analysis. NOS 1 and NOS 2 expression were detected in 42.1% and 55% of the cases, respectively. Nitrotyrosine expression was observed in 18.7% ofthe cases. Bcl-2, bax, p53, fas, fasL and LMP1 expression were observed in 35.1 %, 44.4%, 44.4%, 93,6%, 5.8% e 49.7o/o of the cases, respectively. The EBER-1 transcript was detected in 46.8% of the cases. Significant associations were established between fas and male gender (p=0.032), EBV (LMP-1 e EBER) and male gender (p<0.0001), EBV (LMP-1 e EBER) and mixed cellularity subtype (p<0.0001), EBV and late stages ofthe disease (LMP-1, p=0.0459; EBER, p=0.011 ), EBV (EBER) and B symptons (p=0.0481), bax and p53 (p=0.036), bax and fasL (p=0.046), NOS1 and p53 (p=0.006), bax and NOS2 (p=0.022); and between bcl-2 e NOS2 (p=0.034). An inverse correlation was observed between EBV (LMP-1) and NOS2 (p=0.018), and between EBV and bcl-2 (LMP-1, p=0.002; EBER, p=0.006). Strong NOS2 expression was associated with a shorter overall survival (p=0.0098). It also predicted a poor prognosis in those cases treated with MOPP/ ABVD (p=0.0003). Regarding NLPHL, NOS1 and NOS2 expression by L&H cells was detected in 42.9% and 71.4% ofthe cases, respectively. Nitrotyrosine expression was not detected. Conclusions. We conclude that H-RS cells are capable of expressing NOS and producing NO. They are also capable of producing many apoptosisassociated proteins. The correlations observed between NOS and apoptosisassociated proteins suggest that NOS and NO are involved in the defective apoptotic program of HL. Strong NOS2 expression is associated with a poor outcome in HL. We also conclude that L&H cells ofNLPHL express NOSI and NOS2. Nitrotyrosine expression, however, could not be established.