Desenvolvimento, caracterização e avaliação in vitro de cimento ósseo à base de nano hidroxiapatitas substituídas com magnésio, estrôncio e zinco / Development, characterization and in vitro evaluation of bone cement based on nano-hydroxyapatites substituted with magnesium, strontium and zinc

RESUMO

A incorporação de íons na estrutura da hidroxiapatita (HA) pode afetar sua estrutura, cristalinidade, solubilidade e citotoxicidade. Dentre os íons presentes na composição da apatita óssea, o magnésio (Mg2+), estrôncio (Sr2+) e zinco (Zn2+) são reconhecidos por promover a angiogênese e osteogênese. Portanto, as HAs substituídas podem apresentar melhor bioatividade, por fornecer íons com potencial de estimular a neoformação óssea nos locais enxertados. Nesse contexto, este estudo descreve a síntese, caracterização e comparação de uma série de nano-hidroxiapatitas (nHAs) substituídas e co-substituídas por Sr2+, Mg2+ ou Zn2+. Em seguida, foi desenvolvido um cimento ósseo à base das HAs com melhores resultados de citotoxicidade, associado ao DCPA, gelatina e quitosana. As nHAs foram caracterizadas físico-quimicamente usando diferentes técnicas. O método de co-precipitação foi eficaz para sintetizar HAs de dimensões nanométricas. Comparado a nHA pura, os difratogramas, espectros de FTIR e parâmetros de rede das nHAs substituídas e co-substituídas exibiram alterações, indicando que a incorporação de cátions resultou em distorções da rede da HA. Os testes de MTT demonstraram que as nHAs sintetizadas não foram citotóxicas, após contato direto com culturas de fibroblastos (L929) e pré-osteoblastos (MC3T3). Os resultados obtidos sugerem que as nHAs co-substituídas por Mg2+/Sr2+ e Zn2+/Sr2+ parecem induzir maior proliferação de células fibroblásticas e osteoblásticas, quando comparado a HA pura e substituída. Os cimentos ósseos desenvolvidos apresentaram capacidade de auto-endurecimento e resistência à lavagem. Além de possuírem alta molhabilidade e um perfil de liberação de íons Ca2+, Sr2+, Mg2+ e Zn2+, que está dentro das doses indicadas para estimular a proliferação de osteoblastos. Os cimentos exibiram excelente biocompatibilidade in vitro em culturas de células fibroblásticas, endoteliais e osteosblásticas. Os cimentos contendo nHAs co-substituídas por Mg2+/Sr2+ exibiram os melhores resultados de viabilidade celular. Após 24 horas de contato indireto com cultura de células fibroblásticas L929, o crescimento celular do grupo C2 foi maior que de todos os grupos em estudo (P < 0,01). Em cultura de células endoteliais EA.hy926, o percentual de células viáveis do grupo C3 foi significativamente maior que de todos os outros grupos, após 24 horas (p < 0,001). A citotoxicidade indireta em cultura de células pré-osteoblásticas MC3T3 revelou que após 48 horas, o grupo C3 apresentou maior viabilidade celular que todos os grupos em estudo (p < 0,01). O teste de formação de tubo sugere que todos os cimentos desenvolvidos possuem potencial angiogênico, sendo que os cimentos contendo nHAs co-substituídas por Zn2+/Sr2+ exibiram resultados significativamente superiores (p < 0,001). Apesar de ser necessário um maior número de testes de biocompatibilidade; a incorporação de íons na rede cristalina das nHAs, que são reconhecidos por afetar a angiogênese e a osteogênese, parece ter resultado no desenvolvimento de cimentos ósseos com potencial para promover a regeneração óssea.

ABSTRACT

The incorporation of ions into the HA lattice can affect its structure, crystallinity, solubility and cytotoxicity. From the ions present in the composition of bone apatite, Mg2+, Sr2+ and Zn2+ are recognized for promoting angiogenesis and osteogenesis. The substituted HAs can be present better bioactivity for supplying ions with potential to stimulate bone neoformation in grafted sites. This study described the synthesis, characterization and comparison of a range of substituted and co-substituted nHAs contained Sr2+, Mg2+ or Zn2+. Then, it developed bone cement based on HAs with better cytotoxicity results, associated with DCPA, gelatin and chitosan. The nHAs were physicochemically characterized using different techniques. The co-precipitation method was effective for synthesizing HAs with nanometric dimensions. Compared to pure nHA, the diffractograms, FTIR spectra and lattice parameters of the substituted and co-substituted nHAs showed changes, indicating that the incorporation of cations resulted in distortions of the HA lattice. MTT tests demonstrated that the all synthesized nHAs were not cytotoxic after direct contact with fibroblasts (L929) and pre-osteoblasts (MC3T3) cultures. MTT results suggest that Mg2+/Sr2+ and Zn2+/Sr2+ co-substituted nHAs seem to induce more proliferation of fibroblastic and osteoblastic than pure and Mg2+, Sr2+ and Zn2+ substituted nHAs. Bone cements developed showed self-hardening and washout resistance. Also, they Exhibited high wettability and ion release profile with non-toxic concentrations of Ca2+, Sr2+, Mg2+ and Zn2+, range within indicated doses to stimulate the proliferation of osteoblasts. The cement exhibited excellent in vitro cytocompatibility in fibroblastic, endothelial and osteoblastic cell cultures. Cement containing Mg2+/Sr2+ co-substituted nHAs showed better results of the cell viability. After 24 hours of indirect contact with L929 fibroblast culture, the cell growth in the C2 group was highest than all study groups (P <0.01). In EA.hy926 endothelial culture, the cell viability of the C3 group was significantly highest than all other groups after 24 hours (p <0.001). The indirect cytotoxicity in MC3T3 pre-osteoblastic culture revealed that after 48 hours, the C3 group showed the greatest cell viability than all the study groups (p <0.01). The tube formation assay suggests that all cement have angiogenic potential, being that the cements containing Zn2+ / Sr2+ co-substituted nHAs exhibited significantly better results (p < 0,001). Despite being necessary to perform a more significant number of biocompatibility tests, the incorporation of ions into the nHA lattice, which are recognized for affects angiogenesis and osteogenesis, may have resulted in the development of bone cements with the potential to promoting bone regeneration.