Validation of a one-tube nested real-time PCR assay for the detection of Cryptosporidium spp. in avian fecal samples / Validação da nested PCR em tempo real em um tubo para detecção de Cryptosporidium spp. em amostras fecais de aves

ABSTRACT

Abstract The aim of this study was to validate a one-tube nested real-time PCR assay followed by genetic sequencing to detect and identify Cryptosporidium species and genotypes in birds. A total of 443 genomic DNA extracted from avian fecal samples were analyzed by one-tube nested real-time PCR and conventional nested PCR. By one-tube nested real-time PCR, 90/443 (20.3%) samples were positive for Cryptosporidium spp. In contrast, 36/443 (8.1%) samples were positive for Cryptosporidium spp. by conventional nested PCR. The analytical sensitivity test showed that one-tube nested real-time PCR detects approximately 0.5 oocyst (2 sporozoites) per reaction. An evaluation of analytical specificity did not reveal amplification of microorganisms that commonly present nonspecific amplification with primers used for the diagnosis of Cryptosporidium spp. The repeatability analysis showed the same result in 27 out of 30 samples (90%). As for the reproducibility of one-tube nested real-time PCR, 24 of the 30 samples examined (80%) showed the same result. All the 90 samples amplified by one-tube real-time nested PCR were successfully sequenced, leading to the identification of C. baileyi, C. galli, C. meleagridis, C. proventriculi, and Cryptosporidium avian genotype I. Genetic sequencing of conventional nested PCR amplicons was successful in 10/36 (27.8%) of positive samples.

RESUMO

Resumo O objetivo deste trabalho foi validar um protocolo de nested PCR em tempo real em um tubo (nPCR-TR-1T) seguida de sequenciamento genético para detectar e caracterizar as espécies e genótipos de Cryptosporidium em aves. Um total de 443 amostras de DNA genômico, extraído de amostras fecais de aves, foi analisado pela nPCR-TR-1T e pela nested PCR convencional. Pela nPCR-TR-1T, foi observada positividade para Cryptosporidium spp. de 20,3% (90/443), em contraste com a nested PCR convencional, que apresentou positividade de 8,1% (36/443). O teste de sensibilidade analítica mostrou que a nPCR-TR-1T detecta aproximadamente 0,5 oocisto (2 esporozoítos) por reação. A avaliação da especificidade analítica não revelou amplificação de microrganismos que comumente apresentam amplificação inespecífica com primers utilizados para o diagnóstico de Cryptosporidium spp. O cálculo da repetibilidade evidenciou o mesmo resultado em 27 de 30 amostras (90%). Em relação à reprodutibilidade da nPCR-TR-1T, foi observado o mesmo resultado em 80% (24/30) das amostras examinadas. Foi possível realizar o sequenciamento em todas as 90 amostras amplificadas pela nPCR-TR-1T, com identificação de C. baileyi, C. galli, C. meleagridis, C. proventriculi e Cryptosporidium genótipo I em aves. O sequenciamento dos fragmentos amplificados pela nested PCR convencional foi possível em 10/36 (27,8%) das amostras positivas.