DESARROLLO DE UNA METODOLOGÍA POR CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR PARA LA DETERMINACIÓN DE POLIRRIBOSIL-RIBITOL-FOSFATO (PRP) LIBRE Y CONJUGADO A TOXOIDE TETÁNICO (PRP-TTD) EN VACUNAS ANTI HAEMOPHILUS INFLUENZAE TIPO B / Development of a size exclusion chromatography method for a determination of free polyribosyl-ribitol-phosphate (PRP) and conjugated to tetanus toxoid (PRP-TTD) in Haemophilus influenzae type B vaccines

RESUMEN

Haemophilus influenzae tipo b es un patógeno oportunista responsable de infecciones invasivas y graves como bacteriemia y meningitis bacteriana aguda en poblaciones susceptibles, principalmente en niños menores de 5 años de edad. Su antígeno capsular, el polirribosil-ribitol-fosfato, es un polisacárido específico del serotipo b y ha sido utilizado para la producción de vacunas, inicialmente en forma aislada, con escaso éxito debido a la pobre estimulación inmune en la población objetivo, dando una protección poco sostenida en el tiempo. Surgieron así las vacunas conjugadas, usadas actualmente, donde el polisacárido capsular se une a una proteína carrier para generar una respuesta inmune timo-dependiente, con memoria inmunológica, y apta para el uso en niños a partir de los 2 meses de edad. El polirribosil-ribitol-fosfato se caracteriza por ser una secuencia polimérica del azúcar fosfatado de largo variable, formando una mezcla con diferente abundancia de pesos moleculares. El largo de las cadenas polisacarídicas es un parámetro de calidad del proceso productivo de estas vacunas, y se controla mediante técnicas de cromatografía de exclusión molecular. El presente trabajo consistió en desarrollar una técnica analítica para la determinación de polirribosil-ribitol-fosfato en su forma libre, y conjugado a toxoide tetánico, presentes en vacunas anti Haemophilus influenzae tipo b, utilizando cromatografía de exclusión molecular acoplada a detectores por índice de refracción y por luz ultravioleta a longitudes de onda de 215 y 280 nm. El desarrollo se planteó sobre antecedentes bibliográficos que describen una metodología similar como control de la instancia de conjugación en el proceso productivo del ingrediente farmacéutico activo de vacunas anti Haemophilus influenzae tipo b. En el procedimiento se utilizaron estándares internacionales de los analitos libres y estándares de pesos moleculares, y se evaluó la capacidad del sistema para discriminar los componentes de la vacuna y detectar diferencias que podrían indicar un compromiso en la calidad de la misma.

ABSTRACT

Haemophilus influenzae type b is an opportunistic pathogen responsible for invasive and severe infections such as bacteremia and acute bacterial meningitis in susceptible populations, mainly children under 5 years of age. Its capsular antigen, polyribosylribitol-phosphate, is a specific polysaccharide of serotype b and has been used to produce vaccines, initially in isolation, with little success due to poor immune stimulation in the target population, and providing little sustained protection over time. Thus, arose the conjugated vaccines currently used, where the capsular polysaccharide binds to a carrier protein to generate a thymusdependent immune response with immunological memory and suitable for use in children from 2 months of age. Polyribosyl-ribitolphosphate is characterized by being a polymeric sequence of the phosphated sugar of variable length, forming a mixture with Emilia Ojeda Zachara*, Gisela Severino*, Ana Carolina Abba*, Patricia Aprea. Departamento del Laboratorio Nacional para el Estudio y Control de Biológicos, Dirección de Evaluación y Control de Biológicos y Radiofármacos, Instituto Nacional de Medicamentos. Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica, Buenos Aires. Argentina. Correspondencia Emilia Ojeda Zachara (emilia.ojeda@anmat.gob.ar) *Estos autores contribuyeron equitativamente al desarrollo de este trabajo. Recibido 26 de julio de 2021. Aprobado 1 de diciembre de 2021. Revista Científica ANMAT. Año 5 (vol 2), 2021 different abundances of various molecular weights. The length of the polysaccharide chains is a quality parameter of the production process of these vaccines, and is controlled by size-exclusion chromatography techniques. The presented work consisted in developing an analytical technique for the determination of polyribosyl-ribitol-phosphate in its free form and conjugated to tetanus toxoid present in vaccines against Haemophilus influenzae type b, using size-exclusion chromatography coupled to refractive index and UV detectors at wavelengths of 215 and 280 nm. The development was based on bibliographic backgrounds that use a similar methodology as a control of the conjugation step in the production process of the active pharmaceutical ingredient of anti-Haemophilus influenzae type b vaccines. In the procedure, international standards for free analytes and molecular weight standards were used, and the ability of the system to discriminate the vaccine components and to detect differences that could indicate a compromise in the quality of this vaccine was evaluated