Ação do Amblyomin-X no processo de coagulação sanguínea / The action ofAmblyomin-X in the blood clotting process

ABSTRACT

Hemostasis is a biological event, responsible for the smooth blood flow in blood vessels, made up of related elements such as coagulation, fibrinolysis and endothelium. Amblyomin-X is a recombinant protein characterized as an inhibitor of the Kunitz type, expressed in the prokaryotic system (E. coli) and the eukaryote system (P. pastoris) and also capable of inhibiting FXa in blood coagulation. FXa is a protein essential for triggering the clotting mechanism. Once in its active form (FXa) causes a thrombin generation and, finally, the formation of the fibrin clot. In this study, we evaluated the effect of Amblyomin-X in human and rabbit plasmas. Amblyomin-X was injected (1 mg / kg) on the marginal ear vein of rabbits and blood samples were collected at different times (30 min, 2, 4 and 24 ), and were submitted to analysis of activated partial thromboplastin time (aPTT) and prothrombin time (PT). In parallel, human blood from healthy donors treated with Amblyomin-X were subjected to the same tests. The results showed that Amblyomin-X was able to prolong the PT and APTT in rabbit’s plasma, and APTT but not PT in human plasma. Furthermore, the kinetics of enzyme inhibition by Amblyomin-X was also evaluated Amblyomin-X inhibited different enzymes (Plasmin, FXa, and Trypsin) in a non-competitive manner. The Ki valves for plasmin, FXa and trypsin inhibition by Amblyomin-X were 3.8, 2.2 and 3.0 µM respectively. A 55% inhibition on the tenase complex was observed and also a 44% inhibition of the Factor Xa, and in both cases the inhibitor concentration was the same (3.0 µM). These results indicate an anti-coagulant, or anti-thrombotic, activity of Amblyomin-X. Therefore, Amblyomin-X might be a promising novel candidate for hemostatic disorders.

RESUMO

A hemostasia é um evento biológico, responsável pela fluidez do sangue nos vasos sanguíneos, composto por elementos relacionados à coagulação, fibrinólise e endotélio. O Amblyomin-X, é uma proteína recombinante caracterizada como inibidor do tipo Kunitz, expressa em sistema procarioto (E. coli) e em sistema eucarioto (P. pastoris) e é capaz de inibir o FXa da coagulação sanguínea. O FXa é uma proteína essencial para o desencadeamento do mecanismo de coagulação uma vez que a sua forma ativa (FXa) provoca a geração de trombina que é responsável pela formação do coágulo de fibrina. Neste estudo, avaliou-se a ação do Amblyomin-X em plasma de humanos e de coelhos. O Amblyomin-X foi injetado (1 mg/kg) pela veia marginal da orelha dos coelhos e amostras de sangue foram coletadas em diferentes tempos (30 min, 2, 4 e 24 horas), e foram submetidos às análises de tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa) e tempo de protrombina (TP). Em paralelo, sangue humano de doadores sadios foram tratados com Amblyomin-X e submetidos aos mesmos ensaios para plasmas de coelhos. Os resultados mostraram que o Amblyomin-X foi capaz de prolongar o TP e o TTPa, em plasma de coelhos e o TTPa em plasma humano, mas não o TP. Também foi avaliada a cinética enzimática de inibição ocasionada pelo Amblyomin-X, verificou-se que o Amblyomin-X inibiu de forma não competitiva as diferentes enzimas (Plasmina, FXa, Tripsina). O Ki para a Plasmina, FXa e Tripsina foi de 3,8; 2,2 e 3,0 µM respectivamente. Verificou-se também inibição de 55% no complexo tenase e 44%, sobre o FXa, utilizando a mesma concentração de inibidor (3,0 µM). Os resultados sugerem ação anticoagulante ou ainda antitrombótica do Amblyomin-X, que poderá tornar-se um novo candidato para distúrbios hemostáticos.