Caracterização das microvesículas presentes no veneno de Crotalus durissus terrificus / Caracterization of the microvescles present in Crotalus durissus terrificus venom

ABSTRACT

The Crotalus durissus terrificus (Cdt) venom is constituted by toxins that are responsible for the clinical complications caused by envenoming. These toxins are not the only components presents in the venom; numerous electron-dense microvesicles (40 – 80 nm in diameter) are observed on the luminal face of secretory cells of venom gland and in the venom of Cdt. This microvesicles originate from microvilli by fragmentation or membrane budding and have intramembranous particles on the cytoplasmic leaftet, suggesting the presence of transmembrane proteins. The aim of this study was to identify and characterize specific proteins in the microvesicles from Cdt venom. The venom used was manually extracted from Cdt snakes maintained in the Laboratory of Herpetology at Instituto Butantan. The microvesicles were isolated by ultracentrifugation. Supernatant (S2) from the first ultracentrifugation, venom without microvesicles, and crude venom were used as controls. Morphological analysis showed that after two ultracentrifugations the microvesicles kept their morphology. One-dimensional electrophoresis assay showed band of approximately 72, 148, 176, 272 and 323 kDa that were present only in the microvesicle extract. Analysis of two-dimensional electrophoresis confirms the presence these specific microvesicle proteins. When S2 was used as a control, 18 spots were detected only in microvesicle extract. These spots are 1) approximately 180 kDa with pI around 4; 2) ranging from 60 to 70 kDa with pI ranging from 7 to 9; 3) 11 kDa with PI 4; 4) approximately 10 kDa with pI ranging from 5 to 7 or 9 to 10. However, when fresh crude venom was used as a control, besides the 18 spots, 10 more spots were detected in S2 and microvesicle extract that is not present in the crude venom (spots of 36 kDa and pI ranging from 5 to 7 and spots of 32 kDa and pI ranging from 9 to 10). Western Blotting analysis showed that the Crotalus antivenom recognize only some microvesicle proteins. The identification of proteins by mass spectrometry showed the presence of cellular membrane and intracellular proteins. Identified membrane cellular proteins are ecto-5´nucleotidase, aminopeptidase N and angiotensin-converting enzyme-like. Identified intracellular proteins are Ankyrin repeat domain-containing protein 62, N-acylglucosamine 2-epimerase, leucine-rich repeat, immunoglobulin-like domain and transmembrane,domain-containing protein 3 DNA fragmentation factor subunit alpha isoform 1, protein phosphatase 1 regulatory subunit 26. In conclusion, we showed that after ultracentrifugations the microvesicles kept their morphology, but some of them seem to be lysed since 10 spots were found only in S2 and microvesicles extract, but not in the crude venom. Besides, the protein identified could have a role in metabolic pathways that regulates the integrity of the secretory cells. In addition, these proteins could have a relevant role in envenoming according to their functions described in the literature. The participation of the microvesicles in pathophysiology process shows its importance and open new avenues towards an understanding of their role in the envenoming.

RESUMO

O veneno de Crotalus durissus terrificus (Cdt), é constituído por toxinas responsáveis pelas complicações clínicas que ocorrem durante o envenenamento, entretanto, estas toxinas não são os únicos componentes presentes no veneno, numerosas microvesículas de conteúdo elétron-denso (40-80 nm de diâmetro) são observadas na face luminal das células secretoras da glândula de veneno, bem como no veneno coletado. Estas estruturas originam-se de microvilos por fragmentação ou brotamento e possuem partículas intramembranosas na face citoplasmática sugerindo a presença de proteínas transmembrânicas. O objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar as proteínas presentes nas microvesículas do veneno de Cdt, correlacionando suas possíveis funções através de dados já conhecidos na literatura. Em nossos estudos, utilizamos veneno extraído de Cdt, mantidas em cativeiro no Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan. Isolamos as microvesículas do veneno de Cdt através de ultracentrifugações. O Sobrenadante (S2) da primeira ultracentrifugação, veneno sem microvesículas, e o veneno bruto foram utilizados como controles. A análise morfológica por microscopia eletrônica de transmissão mostrou que a morfologia das microvesículas se mantém mesmo após as duas ultracentrifugações. Em eletroforese unidimensional detectamos bandas em torno de 72, 148, 176, 272 e 323 kDa que estão presentes somente no extrato de microvesículas. A análise do perfil protéico em eletroforese bidimensional confirmou a presença de proteínas específicas de microvesículas. Quando S2 foi utilizado como controle, 18 spots foram detectados somente no extrato de microvesículas (spots de180 kDa com pI em torno de 4; spots entre 60 a 70 kDa com pI em torno de 7 a 9; spots de 11 kDa com pI 4; spots de 10 kDa com pI entre 5 a 7 e 9 a 10). Entretanto, quando o veneno bruto foi utilizado como controle, mais 10 spots foram detectados em S2 e extrato de microvesículas (spots de 36 kDa e pI em torno de 5 a 7 e spots de 32 kDa e pI em torno de 9 a 10). A análise por Western blotting, utilizando soro anticrotálico como fonte de anticorpos, mostrou que somente algumas proteínas das microvesículas são reconhecidas. As identificações das proteínas, por espectrometria de massa, mostraram a presença de proteínas de membrana celular e proteínas intracelulares. As proteínas de membrana celular identificadas foram ecto-5´-nucleotidase, aminopeptidase N e enzima conversora de angiotensina. As proteínas intracelulares identificadas foram proteína contendo domínios de anquirina, N-acylglucosamine 2-epimerase, proteína com domínios ricos em leucina, domínio imunoglobulina e domínio transmembrânico, isoforma 1 da subunidade alfa do fator de fragmentação de DNA e subunidade regulatória da fosfatase 1. Em conclusão, mostramos que após as ultracentrifugações, as microvesículas mantêm sua morfologia, mas algumas delas são lisadas, visto que mais 10 spots foram identificados em S2 e extrato de microvesículas, mas não no veneno bruto. Além disso, as proteínas identificadas podem fazer parte de vias metabólicas que regulam a integridade da célula secretora bem como ter um papel relevante no envenenamento, de acordo com as funções já descritas em literatura. A participação de microvesículas em processos fisiológicos ou patológicos mostra sua importância e abre novas perspectivas de investigação de seu papel no envenenamento.