Análise bioquímica e biológica da secreção cutânea do anuro Dermatonotus muelleri / Biochemistry and biological analysis of skin secretion of anura Dermatonotus muelleri

ABSTRACT

Poisons and secretions animals are among the most complex and rich sources of biological materials, ie new molecules with potential biotechnological applications or pharmaceutical. Accordingly, molecules isolated from amphibian skin secretions may be used as alternatives for the development of new biotechnology tool, such as those target to combat resistant pathogens or develop new industrial products. This project aimed to identify and characterize molecules in the skin secretion of Dermatonotus muelleri (only specie in the genus of the family Microhylidae), through the isolation and biochemical characterization. The secretions were filtered through 10 kDa cut-off membranes and the retained fraction was analyzed by SDS-PAGE, followed by a proteomic approach. A zymographic assay was also performed. The low molecular mass filtrate was fractionated by HPLC and analyzed by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance. Gel electrophoresis showed protein content of various molecular masses. Proteomics analysis found relevant matches for proteins distributed in the electrophoresis gel, including proteolytic enzymes. On the other hand, the < 10kDa fraction showed to contain sugars, according to the interpretation of the NMR data. The ESI-IT-TOF analyses revealed low molecular mass molecules (<800 Da) throughout the chromatographic separation, and tryptophan could be identified among the molecules. The filtered fractions were assayed for antibiotic activity but no inhibition of bacterial growth could be observed. Interestingly, one fraction exhibited a significant increase in the growth of Staphylococcus aureus. The proteomic analysis was pertinent, demonstrating the presence of several proteins related to the animal's biology and defense mechanism. From the chemical point of view, one amino acid was detected and induced bacterial growth, which could be related to alternative mechanisms to the absence of low molecular mass antibiotic compounds.

RESUMO

Venenos e secreções animais estão entre as mais ricas e complexas fontes de materiais biológicos, ou seja, novas moléculas com potencial aplicação biotecnológica ou mesmo farmacêuticas. Nesse sentido, moléculas isoladas da secreção da pele de anfíbios podem ser utilizadas como alternativas biotecnológicas destinadas aos novos medicamentos, como por exemplo, o combate de patógenos resistentes ou no desenvolvimento de novos produtos de utilidade industrial. Assim, esse projeto teve como objetivo identificar e caracterizar moléculas presentes na secreção cutânea de Dermatonotus muelleri (única espécie no gênero da família Microhylidae), por meio do isolamento e caracterização bioquímica. As secreções foram filtradas em membranas de corte de 10 kDa e o material retido foi analisado por SDS-PAGE e em seguida por uma abordagem proteômica. Também foi realizado um ensaio de zimografia. O filtrado de baixa massa foi fracionado por HPLC e analisado por espectrometria de massas e ressonância magnética nuclear. A eletroforese em gel apresentou conteúdo proteico de diversas massas moleculares. A análise proteômica encontrou correspondências relevantes para as proteínas distribuídas no gel de eletroforese, inclusive enzimas proteolíticas. Já os compostos filtrados na membrana de corte de 10kDa, demonstraram conter açúcares de acordo com a interpretação dos dados de RMN. Na análise por ESI-ITToF verificou-se moléculas de baixa massa molecular (<800 Da) ao longo de toda a amostra, sendo identificado o aminoácido triptofano entre elas. As frações filtradas foram ensaiadas para a atividade de antibiótica mas não foi observada inibição do crescimento bacteriano para estas frações, entretanto uma fração apresentou um significativo aumento do crescimento para Staphylococcus aureus. A análise proteômica foi pertinente, tendo demonstrando a presença de diversas proteínas relacionadas a biologia do animal e seu mecanismo de defesas. Do ponto de vista químico detectou-se um aminoácido que apresentou atividade de indução ao crescimento bacteriano, que pode estar relacionada a mecanismos alternativos à ausência atividade antimicrobiana nos compostos de baixa massa molecular.