Interação tumor-estroma durante a transição epitéliomesenquimal in vitro: envolvimento da integrina a11b1 e modulação da Crotoxina sobre este processo / Tumor-stroma interaction during in vitro epithelialmesenchymal transition: involvement of integrin a11 B1 and modulatory effect of Crotoxin on this process

ABSTRACT

During tumor progression, tumor cells are regulated by the microenvironment and acquire highly proliferative behavior within the epithelial compartment, having as characteristic the high motility and invasiveness to the adjacent stroma! tissue. This behavior is a result of the phenotypic alteration of epithelial tumor cells, due to a biological process called epithelial-rnesenchymal transition (EMT). ln this process, fibroblasts are pointed out as fundamental elements in the EMT induction, performing their functions via integrins. Recently, a11 has been shown to be a type I collagen receptor of mesenchyme-derived cells, particularly fibroblasts, which promote cell adhesion and migration to this substrate and may also contribute to the invasion of tumor cells, making it thus, an important target of study. Components obtained from snake venoms modulate integrin-mediated functions, resulting in modulation of cell signaling and consequently regulation of events involved with tumor progressions, such as proliferation, migration, and apoptosis. The aim of this study was 1) to evaluate in vitro the role of a11 integrin on EMT and its importance in the phenotype stabilization; 2) to evaluate the possible inhibitory effect of CTX on the function of this integrin in fibroblasts in spheroid model and; 3) to evaluate the modulatory effect of CTX on key markers in EMT in spheroid model. Firstly, epithelial cell lines (NMuMG and A549) treated with EMT-inducing factors were used to evaluate the expression of epithelial and mesenchymal markers. Secondly, the experimental model used was in vitro interaction between cancer-associated fibroblasts (CAFs-mock or CAF-a11) or normal fibroblasts (MRC-5) and tumor cell lines (A549 or Calu-3), evaluating a) tumor cells proliferation inside the spheroids; b) invasion and migratory behavior of composite spheroids in type I collagen gel; c) secretion of TGF-ß1 by CAFs; d) expression of EMT markers E-cadherin, N-cadherin, vimentin and a-SMA, by immunofluorescence assay and Western blotting; e) quantification of MMPs (9 and 13) by ELISA. Taken together, the data obtained allow us to assert that a11 integrin is modulated by growth factors involved with EMT and that its participation was fundamental for the stabilization of the myofibroblastic phenotype. CTX interfered with CAFs adhesion, tumor cells proliferation and its inhibitory effect during migration and cell invasion is more significant when the tumor-stroma interaction occurs in the spheroid model, accompanied by inhibition of the secretion of active TGF-ß1. Furthermore, CTX inhibited differentiation of MRC-5 cells in the tumor microenvironment and inhibited the expression of N-cadherin, a-SMA and av mesenchymal markers, evaluated in 2D or 3D matrices, by Western blot and confocal microscopy. This study shows CTX as an important modulatory molecule of the EMT process and highlights the mechanisms involved in the antitumor action described for CTX in experimental studies and clinical trials.

RESUMO

Durante a progressão tumoral, as células tumorais são reguladas pelo microambiente e adquirem comportamento altamente proliferativo dentro do compartimento epitelial, tendo como característica a alta motilidade e invasividade ao tecido estremai adjacente. Este comportamento é resultado da alteração fenotípica das células turnarais epiteliais, decorrente de um processo biológico denominado transição epitélio-mesenquimal (EMT). Neste processo, os fibroblastes são apontados como elementos fundamentais na indução da EMT, desempenhando suas funções via integrinas. Muito recentemente, foi demonstrado que a a11 é um receptor para colágeno tipo I de células derivadas do mesênquima, particularmente de fibroblastes, que promovem a adesão e migração celular a este substrato podendo, ainda, contribuir para a invasão das células turnarais, tornando-a assim, um importante alvo de estudo. Componentes obtidos de venenos de serpentes modulam funções mediadas por integrinas, resultando na modulação da sinalização celular e consequentemente, sobre a regulação de eventos envolvidos com a· progressão tumoral, tais como a proliferação, migração e apoptose. Portanto, este estudo tem como objetivos: 1) avaliar in vitro a participação da integri na a11 sobre a EMT e sua importância na estabilização do fenótipo; 2) avaliar o possível efeito inibitório da CTX sobre a função desta integrina em fibroblastes no modelo de esferóide e; 3) avaliar o efeito modulatório da CTX sobre os marcadores-chave na EMT, em modelo de esferóide. Para tanto, primeiramente, foi utilizado linhagens de células epiteliais (NMuMG e A549) tratadas com fatores indutores da EMT para avaliação da expressão dos marcadores epiteliais e mesenquimais. Para o segundo delineamento experimental, foi empregado a interação in vitro entre as linhagens de fibroblastos associados ao câncer (CAFs-mock ou CAF-a11) ou fibroblastos normais (MRC-5) e as linhagens de célula tumoral (A549 ou Calu-3) no modelo de esferóide, avaliando-se a) a proliferação de células turnarais dentro dos esferóides; b) a invasão e o comportamento migratório dos esferóides compostos no gel de colágeno tipo I; c) a secreção de TGF-ß1 pelas CAFs; d) a expressão das moléculas-chave da EMT E-caderina, N-caderina, vimentina e a-SMA, por meio do ensaio de imunofluorescência e de Western blotting; e) quantificação de MMPs (9 e 13) por ELISA. Em conjunto, os dados obtidos nos permite afirmar que a integrina a11 é modulada por fatores de crescimentos envolvidos com a EMT e que sua participação foi fundamental para estabilização do fenótipo miofibroblástico. CTX interferiu com a adesão de CAFs e proliferação das células tumorais. O efeito inibitório da CTX durante a migração e invasão celular foi mais significativo quando ocorreu a interação tumor-estroma no modelo de esferóide, acompanhado da inibição da secreção de TGF-ß1 ativo. Ainda, a CTX inibiu a diferenciação de células MRC-5 no microambiente tumoral e inibiu a expressão dos marcadores mesenquimais Ncaderina, a-SMA e av, avaliados em matrizes 20 ou 30, por Western blot e microscopia confocal. Este estudo mostra a CTX como importante molécula moduladora do processo EMT e evidencia os mecanismos envolvidos na ação antitumoral descrita para a CTX em estudos experimentais e ensaios clínicos.