Caracterização estrutural e funcional de uma metaloproteinase de classe P-I do veneno de Lachesis muta rhombeata

ABSTRACT

Rhomb-I, a 23-kDa metalloproteinase was isolated from L. m. rhombeata venom. Its dimethylcasein proteolysis was abolished by metal chelators, and slightly enhanced by Ca2+ and Mg2+ ions, but inhibited by Co2+ , Zn2+ and α2-macroglobulin. In aqueous solution, rhomb-I autoproteolyzed to a 20- and 11-kDa fragments at 37 oC. The amino acid sequence showed high homology with other SVMPs. Rhomb-I causes hemorrhage that may be ascribed to hydrolysis of essential BM, ECM and plasma proteins. It preferentially cleaves the α-chains of fibrin(ogen). Rhomb-I inhibited convulxin- and vWF-induced aggregation on human platelets without significant effect on collagen-stimulated aggregation or other effectors. It digests vWF into a low- molecular-mass multimers of vWF and a rvWF-A1 domain to a 27-kDa fragment as revealed by western blotting with mouse anti-rvWF A1-domain IgG. Incubation of platelets with rhomb-I resulted in adhesion to and cleavage of platelet receptors GPIbα and GPVI to release a 130-kDa and 55-kDa soluble form. Both membrane glycoproteins, GPIbα that binds vWF, together with GPVI which binds collagen, play a key role in mediating platelet adhesion/activation and can initiate (patho)physiological thrombus formation. Conclusions: rhomb-I is implicated in the pathophysiology of Lachesis envenoming by disrupting vasculature, hemostasis and platelet aggregation through impairing vWF-GPIb axis and blocking GPVI-collagen binding.

RESUMO

Rhomb-I, uma metaloproteinase de 23 kDa foi isolada do veneno de L. m. rhombata. Sua ação proteolítica sobre dimetilcaseína foi inibida por α2-macroglobulina, quelantes de metais e por cátions Co2+ e Zn2+ e levemente estimulada por Ca2+ e Mg2+ . Em solução aquosa a 37 oC, rhomb-I sofreu autoproteólise gerando fragmentos de aproximadamente 20 e 11 kDa. A sequência de aminoácidos apresentou alta similaridade com outras SVMPs P-I. Rhomb-I causa hemorragia que pode ser atribuída à hidrólise de proteínas da membrana basal, da matriz extracelular e proteínas plasmáticas. Rhomb-I cliva, preferencialmente, as cadeias Aα da fibrina e do fibrinogênio. Rhomb-I inibiu a agregação induzida por convulxina e pelo fator de von Willebrand (vWF) em plaquetas humanas, sem efeito significativo na agregação estimulada por colágeno ou outros agonistas. Ela digere vWF em multímeros de massas moleculares menores bem como o domínio A1 recombinante de vWF (rvWF- A1) gerando um fragmento de aproximadamente 27 kDa, conforme evidenciado por western blot com IgG anti-rvWF-A1, produzido em camundongos. Após incubar plaquetas lavadas com rhomb-I, foi possível observar por western blot que a proteína liga e cliva as glicoproteínas de plaquetas GPIb e GPVI, liberando as formas solúveis de 130 kDa e 55 kDa, respectivamente. Ambas glicoproteínas, GPIbα que se liga ao vWF, e GPVI que se liga ao colágeno, desempenham um papel fundamental na mediação da adesão/ativação plaquetária e podem iniciar a formação fisiológica ou patológica de trombos. Conclusões: Rhomb-I é uma metaloproteinase classe P-I, hemorrágica, fibrino(geno)lítica que degrada proteínas da matriz extracelular e interfere na função plaquetária pela clivagem de vWF, GPIb e GPVI. Estes resultados indicam que rhomb-I pode estar envolvida na fisiopatologia do envenenamento por Lachesis, perturbando a hemostasia e agregação plaquetária e causando danos à vasculatura.