Validação da importância funcional das Natterinas na resposta imune inata em zebrafish por CRISPR/Cas9, um método de loss-of-function

ABSTRACT

Zebrafish presents Natterin-like isoforms that share identity with the Natterina family, an important aerolysin for membrane penetration and inflammasome activation. The aim of this project is to silence the natterin-like gene in zebrafish using the CRISPR/Cas9 depletion system to assess the molecule's action in the body's immune defense against pathogens and its homeostatic function. Initially, we verified the susceptibility of zebrafish to infection with pathogens that activate the canonical and non-canonical pathways of the inflammasome. Thus, zebrafish larvaes with 1 day post fertilization (dpf) were exposed for 2 h to the bacteria Staphylococcus aureus and to Salmonella typhimurium for analysis of the effect on survival, embryonic development, locomotor activity and activation of the inflammasome immediately after the infection. The larvaes showed defects in embryonic development and behavioral change, and responded to infection by S. aureus and S. typhimurium with the production of mature caspase-a. Then, after synthesizing the sgRNA complex (trcarRNA + natterin-like crRNA, XM_017356964 / 2) for the complementary target in the second exon of the natterin-like gene on chromosome 7 (ID 795232) the complex was microinjected into 0 embryos hpf with Cas9 enzyme in different concentrations (50 μg / nL 250 μg / nL, 50 125, 25 125 and 12.5 125) for gene depletion and obtaining KO embryos. The complete absence of natterin-like in the entire body of embryos depleted by CRISPR/Cas9 was confirmed by in situ hybridization. All concentrations delayed embryonic development with changes in the body's morphology with anomalies development and induced persistent mortality up to 144 hpf, dose-dependent. Lastly, WT larvae and depleted larvae of the natterin-like gene by CRISPR/Cas9 (sgRNA 50 ng/μL Cas9 250 ng/μL) were exposed to infection in 1 dpf by S. aureus and S. typhimurium for 15 min, 30 min, 1 h and 2 h. Immediately after infection, the effect on survival, embryonic development, locomotor activity and activation of the inflammasome was evaluated. The absence of natterin-like in larvae (1 dpf) altered the response to infection by S. aureus and S. typhimurium inducing changes in locomotor activity in zebrafish associated with the decreased production of caspase-a and caspase-b at all times of infection performed. Our results show that natterin-like is crucial for the embryonic development of zebrafish and acts as an effector molecule in the innate immune response against bacterial pathogens activating the inflammasome complex in zebrafish.

RESUMO

Zebrafish apresenta isoformas de Natterin-like que compartilham identidade com a família Natterina, uma aerolisina importante para penetração em membranas e ativação do inflamassoma. O objetivo deste projeto é silenciar o gene da natterin-like em zebrafish utilizando o sistema de depleção CRISPR/Cas9 para avaliar a ação da molécula na defesa imune do organismo contra patógenos e sua função homeostática. Inicialmente verificamos a suscetibilidade do zebrafish para infecção com patógenos que ativam as vias canônica e não-canonica do inflamassoma. Assim, larvas de zebrafish com 1 dia após fertilização (dpf) foram expostas por 2 h às bactérias Staphylococcus aureus e Salmonella typhimurium para análise da sobrevivência, desenvolvimento embrionário, atividade locomotora e ativação do inflamassoma. As larvas apresentaram defeitos no desenvolvimento embrionário e no comportamento locomotor e responderam à infecção por S. aureus (canônico) e S. typhimurium (não- canônico) com a produção de caspase-a madura. Em seguida, após sintetizar o complexo sgRNA (trcarRNA + crRNA natterin-like, XM_017356964/2) para o alvo complementar no segundo exon do gene da natterin-like gene no cromossomo 7 (ID 795232) o complexo foi microinjetado em embrioes de 0 hpf com a enzima Cas9 em diferentes concentracoes (50 μg/nL250 μg/nL, 50125, 25125 e 12.5125) para a depleção do gene e obtenção de embrioes depletados KO. A ausência completa de natterin-like no corpo inteiro dos embriões depletados por CRISPR/Cas9 foi confirmada por hibridização in situ. Todas as concentracoes atrasaram o desenvolvimento embrionario com alterações na morfologia do corpo com desenvolvimento de anomalias e induziram mortalidade persistente ate 144 hpf, dose- dependente. Por fim, larvas WT e larvas depletadas do gene natterin-like por CRISPR/Cas9 (sgRNA 50 ng/μL Cas9 250 ng/μL) foram expostas à infecção em 1 dpf por S. aureus e S. typhimurium durante 15 min, 30 min, 1 h e 2 h. Imediatamente após a infecção foi avaliado o efeito na sobrevivência, no desenvolvimento embrionário, atividade locomotora e na ativação do inflamassoma. A ausência de natterin-like em larvas (1 dpf) alterou a resposta à infecção por S. aureus e S. typhimurium induzindo aumento na mortalidade e hiperatividade locomotora, indicativo de altos níveis de estree ou ansiedade. Confirmamos que a suscetibilidade à infecção nas larvas depletadas de natterin-like está relacionada à expressão deficiente de caspase-a e caspase-b. Podemos concluir que a natterin-like é crucial para o controle da ativação do inflamassoma responsável por garantir uma resposta inflamatória eficiente contra patógenos, visando à eliminação bacteriana e a sobrevivência do próprio hospedeiro.