Caracterizaçäo de um gene de Paracoccidioides brasiliensis homólogo ao LON, que codifica uma proteinase mitocondrial ATP-dependente / Characterization of Paracoccidioides brasiliensis gene LON homologue, encodes a proteinase mitocondrial ATP-dependente

RESUMO

Um gene homólogo ao LON do patógeno humano Paracoccidioides brasiliensis (PbLON) foi clonado, sequenciado e caracterizado (AF239178). O gene codifica para uma proteinase Lon ATP-dependente putativa, que em Saccharomyces cerevisiae é uma proteína induzida pelo calor envolvida na degradaçao de proteínas anormais ou de vida curta da matriz mitocondrial. A fase aberta de leitura (ORF) do PbLON está contida em um fragmento de 3369 bp interrompido por dois introns localizados no segmento C-terminal. As regioes 5' e 3' flanqueando a ORF contém sequências que se assemelham a elementos de início e final de transcriçao. Vários motivos de ligaçao de fatores de transcriçao também foram observados, incluindo HSE e STRE-like, relacionados à resposta de estresse ou de choque térmico, e NIT2, relacionado ao controle do metabolismo de nitrogênio. A proteína deduzida de PbLON consiste em 1063 resíduos de aminoácidos que contém um sinal putativo de importe mitocondrial no N-terminal e regioes conservadas do sítio de ligaçao de ATP (GPPGVGKT) e sítio da serina catalítica (KDGPSAG). A seqüência apresenta alta similaridade com proteínas homólogas de S. cerevisiae, Homo sapiens e Escherichia coli, estando filogeneticamente mais próxima à de levedura. Em P. brasiliensis, um gene homólogo ao MDJ1 (GenBank AF334811) foi encontrado adjacente ao PbLON e parcialmente sequenciado. Os genes possuem uma regiao 5' intergênica comum e possivelmente compartilham elementos de promotor e de transcriçao opostamente orientados. Esta organizaçao cromosomal é interessante, pois Mdj1 p é um chaperone de choque térmico da matriz mitocondrial, e é essencial para degradaçao de substratos desnaturados pela Lon em S. cerevisiae. O mapeamento cromossômico dos homólogos PbLON e PbMDJ1 em P. brasiliensis mostrou que esses genes estao ligados em 12 isolados estudados, mapeando geralmente em uma banda de 10Mb. Através de Southern blot de 13 outros isolados, foi possível distinguir três com um polimorfismo numa regiao 3' do PbLON. Esses genes sao aparentemente de cópia única, sendo que um transcrito de -3,5 kb foi observado para PbLON e outro de -2,5 kb para PbMDJ1. Aparentemente, ambos foram mais expressos após 30 min de choque térmico a 42ºC, como verificado por Northern blot. A presença de mRNA do PbLON foi detectada através de RT-PCR tanto da fase miceliana quanto leveduriforme do fungo. A obtençao da Lon recombinante de P. brasiliensis está em andamento