Caracterização do gene que codifica a enzima álcool desidrogenase (TcADH) e associação da sua baixa expressão com o fenótipo de resistência in vitro do Trypanosoma cruzi ao benzonidazol / Characterization of the gene that codifies the enzyme alcohol dehydrogenases (TcADH) and association of its low expression with phenotype of resistance in vitro of the Trypanosoma cruzi to benzonidazole

RESUMO

Álcool desidrogenases (ADH) pertencem a um grupo de enzimas que catalizam aoxidação reversível de etanol a acetaldeído, com conseqüente redução de NAD. O gene TcADHque codifica a ADH do T. cruzi, foi selecionado pela metodologia microarray por apresentarum nivel de transcrição 4 vezes menor na população do parasito com resistência induzida invitro ao BZ (17LER) quando comparado com seu par sensível (17WTS). A TcADH codificauma proteína de 393 aminoácidos que apresenta um domínio conservado “iron-containingalcohol desidrogenase”. A análise da estrutura primária mostrou que a TcADH é mais parecidacom as ADHs de organismos procariotos do que com seus ortólogos identificados emLeishmania. A atividade enzimática da TcADH foi menor nas cepas de T. cruzi com resistênciainduzida in vitro ao BZ (17 LER). Análises de Western blot mostraram que o anticorpopoliclonal anti-TcADH reconheceu um polipeptídeo de 41,7 kDa em todas as cepas do T. cruzianalisadas. O nível de expressão desse polipeptídeo foi 2 x menor na cepa do T. cruzi 17LERquando comparado com seu par 17WTS, confirmando os dados da atividade enzimática.Ensaios de imunolocalização por microscopia confocal revelaram que a enzima TcADH estápresente no cinetoplasto do parasito. Análise de Northern blot mostrou que a sonda do geneTcADH reconheceu um transcrito de 1,9 Kb com a mesma intensidade para todas amostras doT. cruzi analisadas com exceção da população 17LER que foi 2 vezes menor. Análisequantitativa por PCR em tempo real (qPCR) também mostrou um nível de mRNA 2,5 vezesmenor na população 17LER. Quantificação do número de cópias desse gene por qPCR, mostrouser o mesmo para todas as cepas do T. cruzi analisadas. Neste trabalho, o gene TcADH foicaracterizado pela primeira vez em T. cruzi e foi observado uma menor expressão da enzimaTcADH na população do T. cruzi com resistência induzida in-vitro ao BZ.