Efeitos à distância de feridas cirúrgicas em mucosa oral sobre populações granulocíticas na medula óssea em modelo murino / Remote effects of surgical oral mucosa wounds on populations granulocytes in the bone marrow in a murine model

RESUMO

Neste trabalho procuramos determinar os efeitos à distância de um ferimento cirúrgico único na cavidade bucal (localizado no palato duro, de extensão 3 mm) sobre a medula óssea em camundongos C57BL/6. Para isto, quantificamos células totais, eosinófilos, neutrófilos e fagócitos mononucleares, tanto na medula óssea recém-coletada, como na medula óssea cultivada em presença de diferentes citocinas. As citocinas foram utilizadas para revelar defeitos sutis que não são detectáveis no exame da medula óssea recém-coletada. Na medula óssea recém-coletada, foi encontrado um aumento modesto, mas significativo, nos números de neutrófilos. Em culturas incubadas com Interleucina (IL)-3, foi observada uma redução significativa dos números de células totais, neutrófilos e fagócitos mononucleares. Em culturas incubadas com Fator Estimulante de Colônias de Granulócitos (G-CSF), foram observados efeitos negativos semelhantes aos encontrados com IL-3, com supressão de células totais, neutrófilos e fagócitos mononucleares. Em culturas incubadas com Fator Estimulante de Colônias de Granulócitos e Macrófagos (GM-CSF), foi observada redução significativa somente sobre o número de neutrófilos. O mesmo ocorreu na presença de Fator Estimulante de Colônias de Macrófagos (M-CSF). Utilizamos também rhG-CSF (Filgrastim®), que tem atividade em cultura de células murinas, sendo observado efeito negativo apenas sobre neutrófilos, em contraste com o observado na presença de G-CSF murino. O efeito positivo sobre o número de neutrófilos na medula óssea recém-coletada poderia ser explicado pela exposição a microrganismos da microbiota bucal no local da lesão, causando bacteremia. Para testar esta hipótese, adotamos uma estratégia de desinfecção local (Clorhexidina a 0,2% e 0,04%) antes da realização do corte, e avaliamos a repercussão deste tratamento sobre as diferentes respostas anteriormente caracterizadas. O tratamento com Clorhexidina a 0,2% eliminou os efeitos observados anteriormente sobre os números de células totais, neutrófilos e fagócitos mononucleares. Em contrapartida, após o tratamento com Clorhexidina a 0,04% alguns dos efeitos anteriormente encontrados, quanto aos números de neutrófilos e de fagócitos mononucleares, persistiram. Procuramos também avaliar se o bloqueio da resposta de glicocorticóides endógenos ao trauma cirúrgico, pelo uso de Mifepristone (RU486), antagonista do receptor de glicocorticóides, poderia modificar os efeitos da ferida na cavidade bucal sobre a medula óssea. Não houve evidência de bloqueio específico dos efeitos do trauma com o uso de RU486, comparativamente aos controles que receberam veículo. Em experimentos-piloto, avaliamos os efeitos do trauma cirúrgico, induzido em camundongos BP-2 segundo os protocolos utilizados anteriormente em camundongos C57BL/6, obtendo evidência de respostas importantes entre cepas no padrão de resposta da medula óssea. Dentro das limitações do presente estudo, podemos concluir que o trauma cirúrgico bucal atinge a medula óssea à distância, demonstrando efeitos positivos 24h após o trauma e negativos quando utilizamos citocinas. Além disso, a presença de bactérias bucais é responsável pela depressão da resposta da medula. (AU)

ABSTRACT

In this study, we aimed to identify, using C57BL/6 mice, long-distance effects of a single, surgical oral wound of 3 mm extension in the hard palate, on the bone marrow. To do so, we enumerated total cells as well as eosinophil, neutrophil and mononuclear phagocytes, from recently harvested bone marrow, and from cultured bone marrow following different cytokine stimuli. Cytokines were used to reveal subtle effects on the recently harvest bone marrow. In recently harvested bone marrow, a small but significant increase was found in neutrophil numbers. In cultures exposed to interleukin (IL)-3 there were decreased total cell, neutrophil and mononuclear phagocyte numbers. In cultures exposed to granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF), reduced total cell, neutrophil and mononuclear phagocyte numbers were observed resembling those in IL-3-exposed cultures. In cultures exposed to granulocytemacrophage-colony stimulating factor (GM-CSF), significant reduction was fund only in neutrophil numbers. The occurred when macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) was used. We also used recombinant human G-CSF (rhG-CSF, Filgrastim®), which acts on murine cells, observing reduction in neutrophil numbers, unlike observations of murine G-CSF. The increase in neutrophil numbers in the fresh bone marrow might be induced by exposure of wounded surfaces to oral microorganisms and possibly by bacteremia. To test this hypothesis, the hard palate was disinfected with clorhexidine (CHX) 0.2% or 0.04%, prior to wounding. The treatment with CHX 0.2% abolished the cytokine effects in the total cell, neutrophil and mononuclear phagocyte numbers. By contrast, after treatment with CHX 0.04%, cytokine effects on the neutrophil and mononuclear phagocyte numbers persisted. We also sought to evaluate whether the effect of oral wounding on bone marrow was dependent on endogenous glucocorticoids. Blockade of the glucocorticoid antagonist receptor with mefipristone (RU486) provided results comparable to those of control group given vehicle only, thus ruling out this hypothesis. In pilot experiments, we also evaluated the effects of surgical trauma in BP-2 mice, using the protocol previously used for C57BL/6 mice, and found significant differences in the bone marrow responses between these two strains. Briefly, our limited experimental evidence shows that oral surgical trauma can influence the bone marrow at distance over a 24h postoperative period, and inducing positive or negative effects on various leukocyte lineages, before and after culture with cytokines. Available evidence points to oral bacteria as involved in these long-distance effects on bone-marrow. (AU)