Caracterização funcional de sistemas de dois componentes em Xanthomonas citri / Functional characterization of two-component systems in Xanthomonas citri

RESUMO

Xanthomonas citri subsp. citri, é uma bactéria pertencente à classe das Gamaproteobactérias, fitopatogênica, que exibe uma especificidade patógeno-hospedeiro extremamente alta. X. citri infecta plantas do gênero Citrus, causando o cancro cítrico, uma doença destrutiva encontrada em cultivos ao redor do mundo. Esta bactéria apresenta em seu genoma 34 genes que codificam proteínas relacionadas com o metabolismo do segundo mensageiro c-di-GMP. Em geral, níveis elevados de c-di-GMP favorecem a sessilidade e a produção de exopolissacarídeos, enquanto níveis mais baixos resultam em maior motilidade e aumento na dispersão do biofilme. Com o intuito inicial de buscar novos alvos de X. citri que dependessem dos níveis intracelulares desse segundo mensageiro, foram analisados os proteomas de linhagens mutantes em diguanilato ciclases específicas. Nas análises proteômicas por eletroforese bidimensional foram identificadas 15 proteínas diferencialmente expressas presentes em mais de um dos proteomas dos mutantes analisados. Entre estas, duas proteínas reguladoras de resposta e preditas de participar de sistemas de dois componentes, XAC0834 e XAC3443, foram encontradas sendo mais expressas em mutantes que apresentavam fenótipo de alto c-di-GMP; enquanto uma proteína hipotética provavelmente presente na membrana, XAC3657, estava mais expressa em linhagens com fenótipos relacionados a baixos níveis de c-di-GMP. Por meio de uma análise por qRT-PCR foi verificado que os níveis de mRNA para XAC0834 e XAC3443 não variam entre as linhagens e, portanto, a diferença nos níveis de expressão destas proteínas deve ocorrer póstranscricionalmente. Como os sistemas de dois componentes e proteínas de membrana são importantes para a adaptação das bactérias a diferentes condições ambientais, o objetivo do presente trabalho foi a caracterização funcional de XAC0834, XAC3433 e XAC3657, com maiorênfase em XAC0834 e na provável proteína sensora cognata, XAC0835, de forma a contribuir para a melhor compreensão dos processos de regulação da virulência de bactérias. Na análise da organização gênica dos genes que codificam estas proteínas, foi verificado que os genes XAC0834 e XAC0835 formam um operon, juntamente com a tioesterase XAC0833 e, portanto, o nível transcricional destes genes ocorre pelos mesmos reguladores, apoiando a hipótese de se tratarem de um sistema de dois componentes; assim como os genes XAC3442 e XAC3443. Utilizando uma linhagem mutante em XAC0834, mostramos que esta proteína impacta positivamente a motilidade sliding e a formação de biofilme, e tem efeito contrário no crescimento de X. citri em meio rico 2xTY e na motilidade twitching. Como estes fenótipos são modulados por c-di-GMP, é possível que a deleção deste gene altere significativamente os níveis de c-di-GMP nas células. Além disto, foi verificado que as proteínas XAC0835, XAC3443 e XAC3657 não afetam a motilidade sliding, mas, individualmente, XAC0835 é importante para a formação de biofilme; XAC3657 afeta negativamente o crescimento de X. citri em meio rico 2xTY; e XAC3443 afeta negativamente a motilidade twitching. Na análise do transcritoma da superexpressão de XAC0834, foi observado que havia aumento na expressão de genes relacionados ao sistema de secreção do tipo IV e na montagem do pilus do tipo IV, em comparação com a linhagem selvagem, o que pode estar relacionado aos fenótipos observados. Este trabalho forneceu subsídios importantes para a compreensão do papel fisiológico do sistema de dois componentes XAC0834/XAC0835, assim como do regulador de resposta XAC3443 e da proteína hipotética, XAC3657, em X. citri, o que pode contribuir para o entendimento da relação de c-di-GMP com os sistemas de dois componentes

ABSTRACT

Xanthomonas citri subsp. citri, is a phytopathogenic Gammaproteobacteria, with extremely high pathogen-host specificity. X. citri infects plants of the genus Citrus, causing citrus canker, a destructive disease found in crops around the world. The genome of X. citri pv. citri 306 (XAC 306) contains 34 genes encoding proteins related to the second messenger c-di-GMP metabolism. In general, high levels of c-di-GMP favor the sessility and exopolysaccharide production, whereas lower levels result in greater motility and increased biofilm dispersion. In order to initially search for new X. citri targets that depend on the intracellular levels of this second messenger, the proteomes of specific diguanylate cyclase mutant strains were analyzed by two-dimensional electrophoresis. Fifteen differentially expressed proteins present in more than one of the mutant proteomes compared to wild type were identified. Among these, two proteins predicted to participate as response regulators in two-component systems, XAC0834 and XAC3443, were found to be more expressed in mutants with high c-di-GMP phenotypes; whereas a hypothetical membrane protein, XAC3657, was more expressed in strains with low cdi-GMP-related phenotypes. Relative mRNA levels for XAC0834 and XAC3443, as determined by qRT-PCR, do not vary among the analyzed strains, suggesting post-transcriptional regulation. Because two-component systems and membrane proteins are important for the adaptation of bacteria to different environmental conditions, the aim of this work was the functional characterization of XAC0834, XAC3433 and XAC3657, with greater emphasis on XAC0834 and its probable cognate sensor protein, XAC0835, contributing to a better understanding of the processes of bacterial virulence regulation. Genes XAC0834 and XAC0835 form an operon, together with the XAC0833 coding for a thioesterase, suggesting that they are co-regulated, aswell as the XAC3442 and XAC3443 genes. Using a mutant strain in XAC0834, we show that this protein positively impacts sliding motility and biofilm formation and has the opposite effect on X. citri growth in rich medium and twitching motility. Because these phenotypes are modulated by c-di-GMP, deletion of this gene may alter cellular c-di-GMP levels. In addition, we found that XAC0835, XAC3443 and XAC3657 proteins do not affect sliding motility, but XAC0835 is important for biofilm formation; XAC3657 negatively affects X. citri growth in rich medium; and XAC3443 negatively affects twitching motility. The RNA-seq transcriptome of X. citri overexpressing XAC0834 was compared to the control strain, and there was an increase in the expression of genes for the type IV secretion system and the assembly of the type IV pilus, which may be related to the observed phenotypes. This work provided important insights for understanding the physiological role of the XAC0834/XAC0835 two-component system as well as the XAC3443 response regulator and the hypothetical protein XAC3657, in X. citri which may contribute to the understanding of the relationship of c- di-GMP with two-component systems