Avaliação da atividade biológica de moléculas de PrPc contendo os polimorfismos nos códons M129V e N171S / Evaluation of biological activity of PrPc molecules with polymorphisms at codons M129V and N171S

RESUMO

A proteína pnon celular, PrPc, é isoforma de uma proteína infecciosa, PrPcS, responsável por doenças neurodegenerativas denominadas encefalopatias espongiformes, e sabe-se que essas moléculas diferem apenas na conformação protéica. PrPc está envolvido com várias funções fisiológicas incluindo homeostase de íons cobre e proteção contra estresse oxidativo, adesão neuronal, extensão e manutenção de neuritos e transdução de sinal. Nosso grupo demonstrou que PrPc é capaz de ligar-se à laminina, sendo que essa interação é importante no processo de neuritogênese. Camundongos nocaute para o gene de PrPc (Prnp) apresentam maior susceptibilidade a drogas convulsivantes, o que levou nosso grupo a avaliar a correlação deste gene com epilepsias humanas. A análise do gene de PrPc mostrou que 23% de um grupo de 100 pacientes com epilepsia relacionada a esclerose hipocampal têm o polimorfismo N171S (em heterozigose), sendo que esta variante alélica não foi encontrada nos 200 controles normais avaliados. No presente trabalho procuramos investigar possíveis alterações na função de PrPc causadas pelo polimorfismo N171S. Este códon encontra-se, na molécula de PrPc, muito próximo ao domínio de interação com a laminina. Por isso, produzimos proteínas PrPc humanas recombinantes com as diferentes combinações do polimorfismos N171S e M129V, e realizamos ensaios de ligação com um peptídeo de laminina que é o ligante de PrPc. Estudamos ainda a compartimentalização celular das diferentes proteínas em fusão com a proteína fluorescente verde (GFP), bem como o padrão de glicosilação das mesmas. Nossos resultados mostram que a afinidade in vitro das proteínas com N ou S no códon 171 por laminina são semelhantes. Além disso as proteínas em fusão com GFP encontram-se distribuídas na superfície celular e ainda em compartimentos intracelulares que correspondem ao complexo de Golgi e vesículas de reciclagem, e possuem o mesmo padrão de glicosilação. Até o momento não encontramos evidências que expliquem a alta prevalência do polimorfismo Nl71 S em pacientes epilépticos. Atualmente o grupo tem estudado sinalização celular desencadeada por PrPc, e pretende também verificar possíveis alterações de vias de sinalização em função do polimorfismo em questão

ABSTRACT

The cellular prion protein, PrPc, is an isoform of an infeccious protein, PrPSc, that is responsible for neurodegenerative diseases named spongiform encephalophaties, and it is known that these molecules differ only on the protein conformation. PrPc is involved in many phisiological functions that include a role in copper metabolism and protection against oxidative stress, neuronal cell adhesion, neurite extention and maintenance and signal transduction. Our group demonstrated that PrPc binds laminin, and this interaction mediates neuritogenesis. PrPc gene (Pnpn) knockout mice have an increased sensitivity to pharmacologically induced seizures, what lead us to evaluate the association of this gene with human epilepsies. Prnp analysis demonstrated that 23% in a group o f 100 patients with mesial temporal lobe epilepsy related to hippocampal sclerosis are heterozigous for a polymorphism at codon 171 (N171S). Nonetheless, this variant allele was not found in 200 control subjects, indicating that it is a rare polymorphism in normal population. In the present work we sought for possible alterations in the PrPc function caused by the polymorphism N171S. This codon is very close to the PrPc-laminin interaction domain. Thus, we produced recombinant human PrPc containing the different combinations of the polymorphisms at codons 171 and 129 (N171S and M129V) and performed binding assays with laminin chain y1 peptide, which is the PrPc ligand. We also studied the cellular compartmentalization of the different PrPc proteins fused to the Green Fluorescent Protein (GFP) and also evaluated their glycosylation pattem. Our results show that laminin affinity for proteins with aminoacids N or S in codon 171 is similar at least in vitro. Furthermore, both proteins fused to GFP are distributed in a similar way at the plasma membrane and in intracellular compartments which are compatible with Golgi complex and recycle vesicles. The proteins also show the same glycosylation pattem. Presently, our data do not show any evidence that elucidate the high prevalence o f polymorphism N 171 S in epileptic patients and the next step will foccus on the cellular signalling triggered by PrPc and possible alterations in signalling dueto the polymorphism at this codon