Avaliação da expressão gênica associada à via de sinalização TGFß em tumores de glândulas salivares / Expression evaluation of genes associated with the TGFß signaling pathway in salivary gland tumors

RESUMO

As glândulas salivares são estruturas formadas por um sistema de ductos e ácinos responsáveis por secretar saliva. Apesar de raros, os tumores de glândulas salivares compreendem um grupo heterogêneo de lesões, apresentando diferentes características histológicas, sendo de difícil classificação e comportamento clínico diverso. A identificação de novos marcadores moleculares tem sido alvo de pesquisas para melhor compreensão e classificação dessas neoplasias, visto que a avaliação da expressão gênica e suas vias envolvidas permite identificar genes associados à regulação que modula o desenvolvimento neoplásico. Assim, novos achados podem direcionar a aplicação de novas técnicas para o diagnóstico, prognóstico e tratamento terapêutico. Contudo, pouco se sabe sobre a via de sinalização TGFß em neoplasias mais comuns em glândulas salivares, como Adenoma Pleomórfico (AP), Carcinoma Mucoepidermoide (CME) e Carcinoma Adenoide Cístico (CAC). Diante disso, torna-se necessário ampliar a pesquisa de genes associados para a determinação de um painel de marcadores e, deste modo, fornecer informações que possam contribuir com o diagnóstico dessas neoplasias. O objetivo desse trabalho foi avaliar a expressão gênica relacionada à via de sinalização TGFß por meio da técnica de RT-PCR em tempo real (qPCR) destacando os marcadores TGFß1, ITGB6, SMAD2, SMAD4, FBN1, LTBP1 e c-MYC. Para tanto, foram selecionadas 13 amostras de AP, 17 de CME e 13 de CAC, além de 10 amostras de glândulas salivares não neoplásicas provenientes de cirurgias realizadas no A.C.Camargo Cancer Center no período do ano 2000 a 2015 e fornecidas pelo Biobanco de Tumores. Os resultados indicam que em pacientes com AP há aumento da expressão dos genes TGFß1, LTPB1, c-MYC e FBN1, enquanto a expressão de SMAD2 diminui quando comparados às amostras não neoplásicas. Em pacientes com CME, foi observada expressão aumentada dos genes TGFß1, ITGB6, FBN1 e c-MYC enquanto a expressão dos genes SMAD2 e SMAD4 diminui ao serem comparados às amostras não neoplásicas. Nos pacientes com CAC, foi observada expressão aumentada em quase todos os genes avaliados. Na análise de clusterização hierárquica não foi possível classificar nas diferentes neoplasias de glândula salivar. Para a validação dos resultados de expressão gênica foi realizada uma meta-análise utilizando dados da literatura, sendo possível observar concordância nos valores de expressão dos genes ITGB6, LTBP1 e TGFß1 em amostras de CME e dos genes FBN1, ITGB6, LTBP1, c-MYC, SMAD2 e SMAD4 nas amostras de CAC. Comparando-se a expressão dos genes entre os três tipos de neoplasias estudados, foi observado aumento de expressão dos genes c-MYC, SMAD2 e SMAD4 nos casos de CAC e aumento da expressão do gene ITGB6 nos casos de CME. A análise de sobrevida demonstrou que, em pacientes com Carcinoma Mucoepidermoide foi observado que a ausência de linfonodo comprometido e ausência de recidiva estão associadas a melhor probabilidade de sobrevida global em 5 anos. Nossos resultados sugerem que a expressão diminuída dos genes SMAD2 e SMAD4 parece não interferir na regulação transcricional de c-MYC, especialmente no AP e CME. Considerando os genes ITGB6, TGFß1, LTBP1, FBN1 e c-MYC a expressão aumentada parece ser relevante para a regulação da via de sinalização no processo de tumorigênese. Sendo assim, este estudo contribui para um melhor entendimento da via de sinalização TGFß em neoplasias de glândulas salivares, além de fornecer informações para o desenvolvimento de potenciais marcadores biológicos para essas neoplasias.

ABSTRACT

Salivary glands are structures formed by a system of ducts and acini responsible for secreting saliva. Although rare, salivary gland tumors comprise a heterogeneous group of lesions, presenting different histological features, difficult classification, and diverse clinical behavior. Identification of new molecular markers has been the subject of researchers for better comprehension and classification of these tumors, since gene expression evaluation and their signaling pathways allow the identification of genes associated with regulation that modulated tumor development. Therefore, new findings can direct the application of new technologies for diagnosis, prognosis, and therapeutic treatment. However, little is known about the TGFß signaling pathway in the most common salivary gland tumors, such as Pleomorphic adenoma (PA), mucoepidermoid carcinoma (MEC), and adenoid cystic carcinoma (ACC). In addition, it is necessary to expand research of genes and associated genes for determining a panel of markers and, thus, provide information that could be contribute with the diagnostic of these neoplasms. The aim of this study is to evaluate the expression of genes associated with the TGFß signaling pathway by real-time RT-PCR (qPCR) highlighting the markers TGFß1, ITGB6, SMAD2, SMAD4, FBN1, LTBP1, and c-MYC. For this purpose, 13 PA samples, 17 MEC samples, 13 ACC samples, and histologically normal salivary glands samples were selected from surgeries performed at A.C.Camargo Cancer Center between 2000 and 2015. These samples were provided by Tumor Biobank. The results indicate that PA patients presented an increased TGFß1, LTPB1, c-MYC, and FBN1 gene expression whereas SMAD2 expression was decreased when compared to the normal samples. In MEC patients, increased expression of TGFß1, ITGB6, FBN1, and c-MYC genes was observed whereas SMAD2 and SMAD4 genes presented decreased expression. In ACC patients, increased expression in almost all genes was observed. In hierarchical clustering analysis it was not possible to classify the different salivary gland tumors. For the validation of the gene expression results it was carried out a meta-analysis using the literature date, being possible to observe an agreement in the expression values of the genes ITGB6, LTBP1 and TGFß1 in MEC samples and FBN1, ITGB6, LTBP1, c-MYC, SMAD2 and SMAD4 in ACC samples. Comparing gene expression among the three tumor types studied it was observed higher expression of c-MYC, SMAD2 and SMAD4 genes in ACC cases and higher expression of ITGB6 in MEC cases. Survival analysis demonstrated that, in MEC patients it was observed that absence of affected lymph nodes and absence of recurrence are associated with better overall survival in 5 years. Our results suggest that the decreased expression of SMAD2 and SMAD4 genes seems not to interfere with the transcriptional regulation of c-MYC, especially in PA and MEC. Considering ITGB6, TGFß1, LTBP1, FBN1 and c-MYC increased gene expression appears to be relevant for the regulation of the signaling pathway in tumorigenic process. Thus, this study contributes to a better understanding of TGFß signaling pathway in salivary gland tumors, apart from supplying information in development of potential biomarkers for these tumors.