Diversidade das metaloproteinases presentes no veneno de Bothrops neuwiedi: identificação de SVMPs que induzem alterações na hemostasia / Diversity of metalloproteinases present in the Bothrops neuwiedi venom: identification of SVMPs that cause alterations on hemostasis

ABSTRACT

The snake venom metalloproteinases (SVMPs) are abundant enzymes in the venoms of viper snakes and responsible for most of the symptoms of envenoming. Their actions are related to the hydrolysis of extracellular matrix components, plasma proteins and hydrolysis or binding to cell surface proteins resulting in the activation or inhibition of their activity. In previous studies we recently found a diversity of SVMPs transcripts produced after stimulation of Bothrops neuwiedi venom gland. In this work, our aim was to characterize the different metalloproteinases in the Bothrops neuwiedi venom affecting hemostasis. Initially, the presence of distinct SVMPs in the venom was accessed by twodimensional electrophoresis and reverse phase chromatography. To obtain fractions enriched with SVMPs and characterize their functional activities, the venom was fractionated into molecular exclusion column, associated with anion exchange column and the resulting pools tested for enzymatic, hemorrhagic and fibrinolytic activities, blood clotting, reactivity with anti-SVMPs antibodies and mass spectrometry. This approach allowed the identification of six SVMPs, four class P-III and two class P-I. The SVMPs class P-III had gelatinolytic and hemorrhagic activities, of these, two had yet fibrinolytic activity. The two P-I were only fibrinolytic. Regarding coagulation activity, at least one P-III was characterized as prothrombin activator and one P-III as factor X activator. We conclude that there is a high variety of SVMPs in Bothrops neuwiedi snake venom, which disturb different hemostatic mechanisms and contribute to symptoms caused by this snake envenoming.

RESUMO

As metaloproteinases de venenos de serpentes (SVMPs) são enzimas abundantes em venenos de espécies da família Viperidae e responsáveis por grande parte dos sintomas do envenenamento. Sua ação está relacionada com a proteólise dos componentes da matriz extracelular, proteínas plasmáticas e também com hidrólise ou ligação a proteínas de superfície celular induzindo a ativação ou inibição da atividade das mesmas. Em estudos com serpentes do “Complexo Bothrops neuwiedi”, verificamos recentemente a diversidade dos transcritos de SVMPs produzidos após estímulo da glândula de veneno. Neste trabalho, o principal objetivo foi caracterizar as diferentes metaloproteinases presentes no veneno de Bothrops neuwiedi com ações na hemostasia. Inicialmente, confirmamos a presença de distintas SVMPs no veneno através de eletroforese bidimensional e cromatografia em coluna de fase reversa. Para a obtenção de frações enriquecidas com SVMPs e caracterização de suas atividades funcionais, o veneno foi fracionado em coluna de exclusão molecular, associado à coluna de troca aniônica e os pools resultantes testados quanto às atividades enzimática, hemorrágica, fibrinolítica, coagulante, reatividade com anticorpos anti-SVMPs e espectrometria de massas. Dessa forma, foi possível a identificação de seis pools contendo SVMPs, sendo quatro da classe P-III e dois da classe P-I. As SVMPs de classe P-III apresentaram atividades gelatinolítica e hemorrágica, destas, duas ainda apresentaram atividade fibrinolítica. As duas P-I foram apenas fibrinolíticas. Com relação à atividade coagulante, foram caracterizadas ao menos uma P-III ativadora de protrombina e uma P-III ativadora de fator X. Com isso concluímos que há grande variedade de SVMPs no veneno de Bothrops neuwiedi, as quais agem em diferentes mecanismos hemostáticos e contribuem para os sintomas causados nos envenenamentos por essa serpente.