Obtenção e atividade biológica de uma nova disintegrina recombinante do veneno de Bothrops neuwiedi, Dis-BnMPIIx / Obtention and biological activity of a new recombinant disintegrin from Bothrops neuwiedi venom, Dis-BnMPIIx

ABSTRACT

Metalloproteinases from snake venoms are highly versatile enzymes, responsible for most of the symptoms of envenoming. Its action is related to the proteolysis of extracellular matrix components, activation or hydrolysis of components of the coagulation cascade and fibrinolysis, platelet aggregation inhibition, induction of local and systemic bleeding, pro-inflammatory activity, among others. This broad variety of biological activities is related to the structural diversity of this family of proteins. The SVMPs are divided into classes and subclasses of PI to PIII according to the organization of their domains. The SVMPs class PI are composed only by the catalytic domain, and in the class PIII, besides catalytic domain, SVMPs have disintegrin-like and cysteine-rich domains. The SVMPs class PII are composed of catalytic and disintegrin domain or only disintegrin that generally present the RGD tripeptide. For a better understanding of the structural and functional diversity of SVMPs, cDNAs from venom gland Bothrops neuwiedi encoding SVMPs were sequenced. SVMPs distinct from those described in venoms of other species were found. The BnMPIIx is a SVMP class PII showing a peculiar sequence with the fusion of a catalytic domain typical of procoagulant class P-III SVMPs with an RGDdisintegrin domain of SVMPs classP-II, with the inclusion of cysteines at positions undescribed previously. The aim of this work was to obtain of BnMPIIx and its disintegrin domain in recombinant form using vectors directing to the E. coli periplasm (pET20) or vectors that produce the recombinant protein in fusion with chaperones (pET32 and pSMT3). For this, the cDNAs encoding BnMPIIx and its disintegrin domain were amplified by PCR, digested with endonucleases BamHI and HindIII and cloned into pET20 vector. The disintegrin domain was also cloned into pET32 and pSMT3 vectors that express proteins with chaperones thioredoxin (Trx) and SUMO, respectively. The sequencing of the inserts did not show any mutations introduced during the cloning procedures. These vectors were transformed into the E. coli BL21 (DE3) or C43 (DE3) strains, and expression was evaluated at two temperatures (30°C and 37°C). To test platelet aggregation, human blood was collected in a 3,8% sodium citrate (19) from healthy donors. The mixture was centrifuged and the platelet-rich plasma (PRP) was submitted to an ADP-induced platelet aggregation assay. The analysis by SDS-PAGE showed that both BnMPIIx as its disintegrin domain were obtained by pET20 partially soluble in both temperatures (30°C and 37°C), resulting in inclusion bodies. Using the vectors pET32 and pSMT3 the disintegrin domain was expressed in a soluble form and was called Dis-Trx or Dis-SUMO respectively. However, the fusion proteins did not show biological activity. After cleavage of Trx it was not possible to isolate the disintegrin to validate the biological activity of Trx-Dis, but after cleavage of SUMO, the isolated disintegrin completely inhibited platelet aggregation in a concentration of approximately 2 µM. After several attempts using different expression vectors, we obtained a new recombinant disintegrin from Bothrops neuwiedi venom in pSMT3 vector, with preserved biological activity.This molecule may contribute to the study of hemostasis and cancer.

RESUMO

As metaloproteinases de venenos de serpentes (SVMPs) são enzimas altamente versáteis, responsáveis por grande parte dos sintomas do envenenamento. Sua ação está relacionada com a proteólise dos componentes da matriz extracelular, ativação ou hidrólise de componentes da cascata de coagulação e fibrinólise, inibição da agregação plaquetária, indução de hemorragia local e sistêmica, atividade pró-inflamatória, entre outras. Essa ampla gama de atividades biológicas está relacionada com a diversidade estrutural dessa família de proteínas. As SVMPs são divididas em classes e subclasses de PI a PIII de acordo com a organização dos seus domínios. As SVMPs de classe PI são compostas apenas pelo domínio catalítico, já as PIII possuem domínio catalítico, tipo disintegrina e rico em cisteína. As SVMPs PII, possuí domínio catalítico e disintegrina ou apenas de disintegrina livre que geralmente apresenta o tripeptídeo RGD. Para melhor entender a diversidade estrutural e funcional das SVMPs, foram sequenciados cDNAs da glândula de veneno Bothrops neuwiedi que codificam SVMPs. Foram encontradas novas SVMPs, distintas das descritas em venenos de outras espécies. A BnMPIIx, uma SVMP de classe PII,apresentou uma sequência bastante peculiar com a fusão de um domínio catalítico similar ao de SVMPs pró-coagulantes da classe P-III com um domínio RGD-disintegrina, de SVMPs classe P-II, contendo cisteínas em posições não descritas anteriormente. O objetivo deste trabalho foi obter a BnMPIIx e seu domínio disintegrina na forma recombinante através de vetores de E. coli que direcionam para o periplasma (pET20) ou vetores que proporcionam a fusão com chaperonas (pET32 e pSMT3). Para isto, o cDNA da BnMPIIx e de seu dominínio disintegrina foram amplificados por PCR, digeridos com as endonucleases BamHI e HindIII e clonados em vetor pET20. O domínio disintegrina também foi clonado nos vetores pET32 e pSMT3 que expressam as proteínas com as chaperonas Tioredoxina (Trx) e SUMO, respectivamente. O sequenciamento de todos os insertos não apresentou mutações. Estes vetores foram transformados nas linhagens de E. coli BL21 (DE3) ou C43 (DE3) e a expressão avaliada em duas temperaturas (30ºC e 37ºC). Para o ensaio de inibição da agregação plaquetária, foi coletado sangue humano de doadores voluntários saudáveis em 3,8% de citrato de sódio (19). O sangue foi centrifugado e o plasma rico em plaquetas (PRP) submetido à agregação plaquetária induzida por ADP. A análise por SDS-PAGE mostrou que tanto a BnMPIIx quanto seu domínio disintegrina foram obtidos parcialmente solúveis em ambas as temperaturas (30ºC e 37ºC), gerando corpos de inclusão em vetor pET20. Já a disintegrina foi obtida com sucesso nos vetores pET32 e pSMT3 e foram denominadas Dis-Trx e Dis-SUMO respectivamente, no entanto não apresentaram atividade biológica. Após a clivagem da Trx, não foi possível isolar a disintegrina para validar a atividade biológica da Dis-Trx, já após a clivagem da SUMO a disintegrina inibiu completamente a agregação plaquetária em concentrações da ordem de 2 µM. Após diversas tentativas de clonagem usando diferentes vetores, nós obtivemos uma nova disintegrina recombinante de Bothrops neuwiedi em vetor pSMT3 com atividade biológica preservada, podendo esta molécula contribuir para os estudos de hemostasia e câncer.