Atividades biológicas do veneno de serpentes Bothrops atrox capturadas na Floresta Nacional do Tapajós, Oeste do Pará / Biological activities of Bothrops atrox snake venom captured at Floresta Nacional do Tapajós, Western Pará

ABSTRACT

Bothrops atrox (Ba) snake is responsible for most of the snakebites in Brazilian Amazon region and its venom induces a variety of local and systemic effects. However, this venom is not included in the pool of immunization used to produce Bothrops antivenom. It is known that the composition of snake venoms and their biological activities can vary not only among species but also within the same species. This variation can be influenced by snake ontogenetic stage, sex or geographical origin. In this work we characterize the electrophoretic profile and coagulant, phospholipase, fibrino(geno)lytic, platelet aggregation, desfibrinogenanting, edematogenic and hemorrhagic activities of Ba venom. We also evaluated the cellular migration induced by this venom and verified the capability of Bothrops antivenom to neutralize the coagulant and desfibrinogenanting activities. Thus, we used the lyophilized crude venom from adult, males (3) and females (3) Ba snakes (n=6), captured at Floresta Nacional do Tapajós (FLONA), Santarém region (Belterra), Pará. Adult B. jararaca (Bj) venom from Instituto Butantan was used in order to compare the results obtained in vitro assays. The Ba and Bj venoms showed differences in the number and intensity of protein bands under reducing or nonreducing conditions. The values of minimum coagulant dose of Ba and Bj venoms, respectively, on bovine plasma (10.87 ± 0.42 and 35.89 ± 0.22 µg/mL) and fibrinogen (17.68 ± 1.67 and 68.25 ± 0.64 µg/mL) indicated that Ba venom was more coagulant. In relation to the activation of procoagulant factors by Ba venom, we found higher activity on factor II (636.71 ± 25.76 µmol p-nitroaniline/min/mg venom) in comparison to factor X (182.15 ± 4.87 µmol p-nitroaniline/min/mg venom). Ba and Bj venoms were able to hydrolyze phospholipids and directly degrade fibrin on dose-dependent, but with different intensities. Both venoms induced a quick degradation of human fibrinogen Aα chain, a slow hydrolysis of the Bβ chain and no degradation of the γ chain, but the Bj venom hydrolyzed the Bβ chain more slowly than Ba venom. Unlike the verified Bj venom, the Ba venom did not induce platelet aggregation. We also observed that Ba venom showed desfibrinogenanting, edematogenic and hemorrhagic activities and induced cellular migration. Interestingly, Bothrops antivenom neutralized the coagulant and desfibrinogenanting activities of Ba venom. Our data indicate variability between the biological activities of Ba venom from FLONA and Bj venom from Instituto Butantan, as well as those of Ba from other geographical origins. This variability may influence on the severity of clinical manifestations observed on victims of snake bites and the necessity or not of more effective antivenoms.

RESUMO

A serpente Bothrops atrox (Ba) é responsável pela maioria dos acidentes ofídicos na região amazônica brasileira e seu veneno induz uma variedade de efeitos locais e sistêmicos. No entanto, este veneno não está incluído no pool de imunização utilizado para a produção do antiveneno botrópico. Sabe-se também que a composição e as atividades biológicas dos venenos de uma mesma espécie de serpente podem apresentar variações ontogenética, sexual ou geográfica. Neste trabalho caracterizamos o perfil eletroforético e as atividades coagulante, fosfolipásica, fibrino(geno)lítica, agregante plaquetária, desfibrinogenante, edematogênica e hemorrágica do veneno de serpentes Ba. Avaliamos ainda a migração celular induzida por este veneno e verificamos a capacidade neutralizante do antiveneno botrópico sobre as atividades coagulante e desfibrinogenante. Para tanto, utilizamos o veneno bruto liofilizado de serpentes Ba (n=6), adultas, machos (3) e fêmeas (3) capturadas na Floresta Nacional do Tapajós (FLONA), região de Santarém (Belterra), Pará. O veneno de B. jararaca (Bj) adulta do Instituto Butantan foi utilizado para comparar os resultados obtidos nos ensaios in vitro. Os venenos de Ba e Bj apresentaram diferenças no número e intensidade das bandas proteicas em condições redutoras e não redutoras. Os valores da dose mínima coagulante dos venenos de Ba e Bj, respectivamente, sobre o plasma (10,87 ± 0,42 e 35,89 ± 0,22 µg/mL) e fibrinogênio bovino (17,68 ± 1,67 e 68,25 ± 0,64 µg/mL) indicam que o veneno de Ba é mais coagulante. Em relação à ativação dos fatores procoagulantes pelo veneno de Ba, verificamos atividade mais elevada sobre o fator II (636,71 ± 25,76 µmol p-nitroanilina/min/mg de veneno) em comparação à do fator X (182,15 ± 4,87 µmol p-nitroanilina/min/mg de veneno). Os venenos de Ba e Bj foram capazes de hidrolisar fosfolipídios e de degradar fibrina diretamente e de forma dosedependente, entretanto com intensidades diferentes. Ambos os venenos induziram uma rápida degradação da cadeia Aα do fibrinogênio humano e nenhuma degradação da cadeia γ; porém o veneno de Bj hidrolisou a cadeia Bβ mais lentamente que o de Ba. Ao contrário do que verificamos com o veneno de Bj, o veneno de Ba não induziu agregação plaquetária. Observamos ainda que o veneno de Ba apresentou atividades desfibrinogenante, edematogênica e hemorrágica, sendo capaz de induzir migração celular. Interessantemente, o antiveneno botrópico neutralizou as atividades coagulante e desfibrinogenante do veneno de Ba. Nossos dados indicam variabilidade entre as atividades biológicas dos venenos de Ba da FLONA e de Bj do Instituto Butantan, assim como com as de Ba de outras origens geográficas. Essa variabilidade pode repercutir na gravidade das manifestações clínicas observadas nas vítimas de acidentes ofídicos e na necessidade ou não de antivenenos mais efetivos.