Clonagem e expressão de anticorpos recombinantes de cadeia única (scFvs) anti-crotoxina: original e mutantes sugeridos por modelagem molecular / Cloning and expression of recombinant single chain antibodies (scFv) anti-crotoxin: original and mutants suggested by molecular modeling

ABSTRACT

Accidents with snakes are a problem of public health. It is estimated that about 1.8 million poisonings by snakes occur every year worldwide, resulting in at least 94,000 deaths. This issue has been included in the list of neglected tropical diseases by the World Health Organization. Among the causative genera of snakebites in Brazil, the genus Crotalus has the highest coefficient of lethality. The venom of the rattlesnake Crotalus durissus terrificus (Cdt) is composed of a mixture of substances including toxins. The majority toxin and main toxic component of the venom is called crotoxin. It is highly toxic and is formed by subunits CA and CB. The administration of heterologous antibodies has been the treatment of choice for snake bite accidents. But its administration may cause hypersensitivity reactions. Furthermore, Crotalic antivenom production by horses is slow and hampered by the action of immunosuppressive components present in the venom of Cdt. Currently, recombinant antibody fragments are becoming popular alternative therapies for whole antibodies. Single chain fragment variable (scFv) comprise the VH and VL domains connected by a short linker flexible and may be useful as treatment for poisoning by snakes. Recombinant human antibodies anti-crotoxin have been previously isolated from a naive library of over 1010scFv by phage display technology. The aim of this study was the expression of original scFvs anti-crotoxin and mutants suggested by modeling molecular. ScFv6 3D model was constructed in silico. Docking and energy minimization calculations of CTX-antibody complex were also performed. From these simulations, three mutations were chosen. The S30A and Y31F mutants have mutation in CDR H2 and CDR H3 in the mutant R103H. The first mutant (S30A) was obtained by site-directed mutagenesis, while the other two (Y31F and R103H) were obtained from synthetic genes. ScFv original and mutants were cloned in pET20b + vector and expressed in E. coli C43 (DE3), resulting in soluble protein of approximately 30 kDa. Expression was induced with IPTG. After lysis, the bacterial content was purified by IMAC. The presence of the desired mutations was confirmed by sequencing. The secondary structure of scFvs was evaluated by circular dichroism and showed to be preserved. We conclude that original scFv and its mutants were clone and expressed successfully in soluble form. All scFv presented similar yield after purification. Moreover, they presented preserved secondary structure, as evaluated by circular dichroism.

RESUMO

Acidentes com serpentes são um problema de saúde pública. Estima-se que ocorram cerca de 1,8 milhões de envenenamentos por serpentes a cada ano no mundo, resultando em pelo menos 94 mil mortes. Tal problema foi incluído na lista de doenças tropicais negligenciadas da Organização Mundial da Saúde. Dentre o gêneros causadores de acidentes ofídicos no Brasil, o gênero Crotalus apresenta o maior coeficiente de letalidade. O veneno da cascavel Crotalus durissus terrificus (Cdt) é composto por uma mistura de substâncias, dentre elas as toxinas. A toxina majoritária e principal componente tóxico do veneno é denominada crotoxina. É altamente tóxica e é formada por duas subunidades CA e CB. A administração de anticorpos heterólogos tem sido o tratamento de escolha para indivíduos que sofreram acidentes ofídicos. Porém, sua administração pode causar reações de hipersensibilidade, além da sua produção ser lenta e dificultada pela ação de componentes imunossupressores presentes no veneno de Cdt. Atualmente, fragmentos de anticorpos recombinantes estão se tornando alternativas terapêuticas populares para substituição de anticorpos íntegros. Fragmentos variáveis de cadeia única (scFv, do inglês, single chain fragmente variable) são compostos dos domínios VH e VL unidos por um pequeno linker flexível e podem ser úteis como terapia para o envenenamento por serpentes. Anticorpos recombinantes humanos anti-crotoxina foram isolados previamente de uma biblioteca naive de mais 1010scFvs pela tecnologia de phage display. O objetivo desse estudo foi a expressão de scFvs anticrotoxina original e mutantes sugeridos por modelagem molecular. Um modelo 3D do scFv6 foi construído por modelagem in silico. Docking e cálculos de minimização de energia do complexo anticorpo-CTX também foram realizados. A partir dessas simulações, três mutações foram escolhidas. Os mutantes S30A e Y31F apresentam mutação no CDR H2 e o mutante R103H no CDR H3. O primeiro mutante (S30A) foi obtido por mutagênese sitio dirigida, enquanto os outros dois (Y31Fe R103H) foram obtidos através de genes sintéticos. O scFv original e os mutantes foram clonados em vetor pET20b+ e expressos em E.coli C43(DE3), resultando em proteínas solúveis de aproximadamente 30 kDa. A indução foi feita com IPTG. Após a lise bacteriana, o conteúdo foi purificado por IMAC. A presença das mutações desejadas foi confirmada por sequenciamento. A estrutura secundária dos scFvs foi avaliada por dicroísmo circular e se mostrou preservada. Concluímos que tanto o scFv original como os mutantes foram clonados e expressos com sucesso na forma solúvel. Todos os scFvs apresentaram rendimentos similares após a etapa de purificação. Além disto, os scFvs apresentaram estrutura secundária preservada, conforme avaliado por dicroísmo circular.