Caracterização bioquímica e farmacológica de compostos analgésicos presentes na secreção das glândulas parotóides dos sapos Rhinella Icterica e Rhinella marina / Biochemical and pharmacological characterization of analgesic compounds from the toads Rhinella icterica and Rhinella marina parotoids glands secretion

ABSTRACT

Currently, natural products are considered an important source of molecules with therapeutic potential. Literature demonstrates that the secretion components of frogs belonging to the Bufonidae family induce antinociceptive effect. Thus, the objectives of this study are to identify and characterize antinociceptive molecules in the secretion of parotid glands of Rhinella icterica and Rhinella marina frogs and to determine their action movements. After an initial screening, we detected the presence of four compounds with analog activity. These compounds were purified by RP-HPLC and reproduced by mass spectrometry such as Dehydrobufotenin, Bufalin, Morinobufagin and Telecinobufagin. The antinociceptive effect of these compounds was applied by the electronic Frey test using the carrageenan induced hyperalgesia model. The results showed that Bufotenin, Telecinobufagin, Marinobufagin and Bufalin at doses of 50 μg, 100 μg and 200 μg after oral administration were able to reverse carrageenan-induced hyperalgesia 30 minutes after treatment, with a peak of professional activity within 1 hour. (p < 0.001). Additionally, no motor alterations were observed for any of the four compounds, which were applied through open field test, elevated cross maze or cytotoxic activity in cardiomyocytes. The mechanisms of action involved in the analytical effect of these compounds are still available. Our results demonstrated treatment with selected antagonist for receptor 5 -HT1a (300 nmol/paw), 5-HT2a (300 nmol/paw), delta opioid (90 μg/paw) and various kappa opioid (75 μg/paw) involved in the treatment. bufotenine alkaloid-induced antinociceptive effect (200 μg/100 μL). Animals composed of steroid compounds telecinobufagin (200 μg/100μL) and marinobufagin (200 μg/100μL) suffered reversible hyperalgesia when injected with selective antagonists AM251 (40 μg/paw) and AM630 (25 μg/paw) revealing or executing receptors. CB1 and CB2, respectively, without antinociceptive effect (p < 0.001). One bufalin (200 μg/100μL) was the only steroid compound that did not involve any tested mechanism, being opioids, cannabinoids and serotoninergics. Therefore, we performed an analysis in molecules databases, considering a bufalin structure in search of action targets. The results obtained from this analysis show that bufalin is activated by chloride channels in vitro. Based on this, the evaluations or involvement of calcium-activated chloride channels and type 2 channels without antinociceptive effect due to their presence in peripheral nociceptive fibers. The results revealed or the involvement of calcium-activated chloride channels (300 μM/paw) without buffalo effect. With these data, we can confirm the antinocieptive activity of the four compounds of the paranoid secretion of the toads R. icterica and R. marina - Bufotenine, Bufalin, Marinobufagin and Telecinobufagin.

RESUMO

Atualmente, os produtos naturais são considerados uma importante fonte de moléculas com potencial terapêutico. A Literatura demonstra que os componentes da secreção de sapos pertencentes à família Bufonidae induzem efeito antinociceptivo. Assim, os objetivos deste estudo são identificar e caracterizar moléculas antinociceptivas na secreção das glândulas parotoides de sapos Rhinella icterica e Rhinella marina e determinar seus mecanismos de ação. Após um screening inicial detectamos a presença de quatro compostos com atividade analgésica. Estes compostos foram purificados por RP-HPLC e identificados por espectrometria de massa como Dehidrobufotenina, Bufalina, Morinobufagina e Telecinobufagina. O efeito antinociceptivo destes compostos foram avaliados pelo teste de von Frey eletrônico, utilizando o modelo de hiperalgesia induzida por carragenina. Os resultados demonstraram que a Bufotenina, Telecinobufagina, Marinobufagina e Bufalina nas doses de 50 μg, 100 μg e 200 μg após administração por via oral, conseguiram reverter a hiperalgesia induzida pela carragenina 30 minutos após o tratamento, com um pico de atividade observado em 1 hora (p<0,001). Adicionalmente, não foram observadas alterações motoras para nenhum dos quatro compostos, que foram avaliados através do teste de campo aberto, labirinto em cruz elevado ou atividade citotóxica em cardiomiócitos. Avaliamos ainda os mecanismos de ação envolvidos no efeito analgésico destes compostos. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com o antagonista seletivo para receptores 5- HT1a (300 nmol/pata), 5-HT2a (300 nmol/pata), delta opióide (90 μg/pata) e kappa opióide (75 μg/pata) estão envolvidos no efeito antinociceptivo induzido pelo alcaloide bufotenina (200 μg/100 μL). Já os animais tratados com os compostos esteroides telecinobufagina (200μg/100μL) e marinobufagina (200μg/100μL) tiveram a hiperalgesia revertida quando foram injetados com os antagonistas seletivos AM251 (40 μg/pata) e AM630 (25 μg/pata) revelando o envolvimento de receptores CB1 e CB2 respectivamente no efeito antinociceptivo (p<0,001). A bufalina (200μg/100μL) foi o único composto esteroide que não apresentou envolvimento de nenhum dos mecanismos testados, sendo eles opióides, canabinóides e serotoninérgicos. Portanto, realizamos análise em bancos de dados de moléculas considerando a estrutura da bufalina na busca por alvos de ação. Os resultados obtidos a partir dessa análise mostraram que a bufalina é ativadora de canais de cloreto in vitro. Com base nisso, avaliamos o envolvimento dos canais de cloreto ativados por cálcio e dos canais tipo 2 no efeito antinociceptivo, devido sua presença em fibras nociceptivas periféricas. Os resultados revelaram o envolvimento de canais de cloreto ativados por cálcio (300 μM/pata) no efeito da bufalina. Com esses dados, podemos confirmar a atividade antinocieptiva dos quatro compostos isolados da secreção das parotóides dos sapos R. icterica e R. marina - Bufotenina, Bufalina, Marinobufagina e Telecinobufagina.