Purificação de IgM a partir de plasma humano empregando cromatografias de troca catiônica

ABSTRACT

Human plasma is full of therapeutic proteins that can be used to treat several diseases, among these proteins are immunoglobulins. IgG is currently the most important blood product because it accounts for around 30% of the market, which was estimated at 20 billion dollars in 2016 and continues to grow. IgM has multiple functions, such as controlling infections, producing dendritic cells and controlling tissue homeostasis. Because of its pentameric structure, IgM can also bind to antigens with greater avidity than other immunoglobulins. However, there are no commercially available IgM concentrates. In this work we studied the purification of plasma-derived IgM using liquid chromatography techniques and resins that can be easily scaled up. In the first step, plasma was purified on a Sepharose 4FF gel-filtration column. The enriched IgM fraction called F2 was then used as sample for cation exchange resin purifications. Experiments were initially carried out on Hi-Trap SP FF with the undiluted F2, five times diluted F2 and ten times diluted F2. Then we scaled up the purification using a 23mL SP Sepharose FF column using F2 diluted 10 times as loading sample. Our results indicate that the best of sample volume was 100mL, which corresponds to 63mg of protein. At pH 6.0 36% of IgM was not adsorbed on the column and 50% was adsorbed. At pH 5.0 IgM was recovered only in the Elution fraction, but the recovery was very poor (38%). Finally we carry out a purification at pH 5.0 using NaCl gradient to elute the adsorbed proteins. Due to the low concentration of proteins in the collected fractions, it was only possible to observe by immunoturbidimetry that 37.3% of IgM eluted in the 300mM NaCl to 500mM NaCl gradient. In this fraction, polyacrylamide gels show that IgG and albumin were present. The results obtained were preliminary and did not yet allow comparison of purification using cation exchange resin with anion exchange resins.

RESUMO

O plasma humano está repleto de proteínas terapêuticas que podem ser utilizadas no tratamento de várias doenças, entre essas proteínas estão as imunoglobulinas. O IgG é atualmente o hemoderivado mais importante porque é responsável por cerca de 30% do mercado, que era estimado em 20 bilhões de dólares em 2016 e continua a crescer. IgM tem múltiplas funções, como controle de infecções, produção de células dendríticas e controle da homeostase dos tecidual. Por conta de sua estrutura pentamérica, o IgM também pode-se ligar a antígenos com maior avidez do que outras imunoglobulinas. Entretanto não existem concentrados de IgM disponíveis comercialmente. Neste trabalho estudamos a purificação de IgM derivada de plasma usando técnicas de cromatografia líquida e resinas que podem ser facilmente escalonadas. Na primeira etapa foi feita a purificação de plasma em uma coluna de gel-filtração Sepharose 4FF. A fração enriquecida de IgM F2 foi então usada como amostra de entrada para as purificações em resina de troca catiônica. Primeiramente foram feitos experimentos em Hi-Trap SP FF com a amostra sem diluir, diluída cinco e dez vezes. Em seguida escalonamos a purificação empregando uma coluna SP Sepharose FF de 23mL usando como amostra de entrada F2 diluída 10 vezes. Verificamos que o volume ideal de amostra aplicada era de 100mL que corresponde a 63mg de proteína de amostra. Verificamos que em pH 6,0 36% de IgM não é adsorvido na coluna e 50% é adsorvido. Em pH 5,0 IgM foi recuperado somente na fração de Eluição, porém a recuperação foi muito baixa (38%). O último passo foi realizar uma purificação em pH 5,0 usando gradiente de NaCl para eluição das proteínas adsorvidas. Devido a baixa concentração de proteínas nas frações recolhidas foi possível apenas observar por imunoturbidimetria que 37,3% de IgM elui no gradiente NaCl 300mM ao NaCl 500mM. Nessa fração os géis de poliacrilamida mostram que IgG e Albumina estão presentes. Os resultados obtidos são preliminares e ainda não permitem comparar a purificação em resina de troca catiônica com resina de troca aniônica.