Ensayo de neutralización in vitro de aplicación en la evaluación de inmunógenos contra la hepatitis A, obtenidos mediante la tecnología de expresión en fagos filamentosos / In vitro neutralization assay to evaluate new hepatitis A vaccine candidates

RESUMEN

La inmunidad contra el virus de la hepatitis A (VHA) se debe en primera instancia a la inducción de anticuerpos neutralizantes. Disponer de ensayos de neutralización es indispensable para evaluar nuevos candidatos vacunales contra este patógeno. En el presente trabajo se desarrolló un ensayo de neutralización in vitro que permitió evaluar la inmunogenicidad de mimotopos del VHA obtenidos mediante la tecnología de expresión en fagos al ser inmunizados ratones Balb/c. Diferentes diluciones de anticuerpos se incubaron con 10³ o 10² Dosis Infecciosas en Cultivo de Tejidos 50 por ciento (DICT50) del clon citopàtico HM175/18f de VHA, y se inocularon en placas con células FRhK4. Después de 7 días de incubación el título neutralizante se determinó como el recíproco de la dilución del suero capaz de reducir la multiplicación viral al 50 por ciento. Tanto 10³ como 10² DICT50 fueron neutralizadas por el anticuerpo monoclonal 7E7 y los sueros humanos (A12 y A31) positivos a anticuerpos anti-VHA. Los controles negativos del ensayo no neutralizaron al virus. Los títulos neutralizantes de los sueros de ratones inmunizados con fagos portadores de mimotopos de VHA oscilaron entre 4 y 16, mientras que los sueros preinmunes y los de ratones inmunizados con fago salvaje M13 no neutralizaron la infectividad viral. Este ensayo de neutralización resultó adecuado para la evaluación de los inmunógenos propuestos(AU)

ABSTRACT

Immunity to hepatitis A virus (HAV) is in first instance due to neutralizing antibodies. Neutralization assays are essential to evaluate new candidate vaccines against this pathogen. In this paper, an in vitro neutralization assay to evaluate HAV vaccine candidates using phage-display technology is described. 10³ and 10² DICT50 of HAV were incubated with different antibodies preparations and were inoculated onto plates with FRhK4 cells. After seven days of incubation, the neutralizing titer was determined as reciprocal of the serum dilution reducing HAV growth (inhibition of CPE) by 50 percent. 10³ and 10² DICT50 were neutralized by 7E7 anti-HAV monoclonal antibody and anti-VHA positive human sera (A12 and A31). Negative controls of the assay did not neutralize viral infectivity. Sera from mice immunized with phages displaying VHA mimotopes had neutralizing titers from 4-16. Neither negative control nor pre-immune and sera from mice immunized with M13 wild type phage neutralized HAV. A simple and faster in vitro neutralization assay was developed to evaluate new HAV vaccine candidates(AU)