Heterogeneous production of proteases from Brazilian clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa / La producción heterogénea de las proteasas a partir de aislamientos clínicos brasileños de Pseudomonas aeruginosa

ABSTRACT

Background: Pseudomonas aeruginosa is an important human pathogen that causes severe infections in a wide range of immunosuppressed patients. Herein, we evaluated the proteolytic profiles of 96 Brazilian clinical isolates of P. aeruginosa recovered from diverse anatomical sites. Methods: Cell-associated and extracellular proteases were evidenced by gelatin-SDS-PAGE and by the cleavage of soluble gelatin. Elastase was measured by using the peptide substrate N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide. The prevalence of elastase genes (lasA and lasB) was evaluated by PCR. Results: Bacterial extracts were initially applied on gelatin-SDS-PAGE and the results revealed four distinct zymographic profiles as follows profile I (composed by bands of 145, 118 and 50kDa), profile II (118 and 50kDa), profile III (145kDa) and profile IV (118kDa). All the proteolytic enzymes were inhibited by EDTA, identifying them as metalloproteases. The profile I was the most detected in both cellular (79.2%) and extracellular (84.4%) extracts. Overall, gelatinase and elastase activities measured in the spent culture media were significantly higher (around 2-fold) compared to the cellular extracts and the production level varied according to the site of bacterial isolation. For instance, tracheal secretion isolates produced elevated amount of gelatinase and elastase measured in both cellular and extracellular extracts. The prevalence of elastase genes revealed that 100% isolates were lasB-positive and 85.42% lasA-positive. Some positive/negative correlations were showed concerning the production of gelatinase, elastase, isolation site and antimicrobial susceptibility. Conclusion: The protease production was highly heterogeneous in Brazilian clinical isolates of P. aeruginosa, which corroborates the genomic/metabolic versatility of this pathogen (AU)

RESUMEN

Antecedentes Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) es un importante patógeno humano que causa graves infecciones en diversos tipos de pacientes inmunodeprimidos. En este trabajo evaluamos los perfiles proteolíticos de 96 aislamientos clínicos brasileños de P. aeruginosaaislados de diferentes localizaciones anatómicas. Métodos: Las proteasas extracelulares y de extractos celulares fueron analizadas por SDS-PAGE copolimerizada con gelatina y a través de clivaje de gelatina en solución. La elastasa fue medida usando el substrato peptídico N-succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida. La prevalencia de genes codificantes para elastasa (lasA y lasB) fue evaluada por PCR. Resultados: En primer lugar, los extractos de las bacterias fueron aplicados en geles de SDS-PAGE-gelatina, los cuales, después de revelados, revelaron 4 perfiles enzimográficos, así perfil I(compuesto por bandas de 145, 118 y 50kDa), perfil II (118 y 50kDa), perfil III (145kDa) y perfil IV (118kDa). Todas las enzimas proteolíticas fueron inhibidas por EDTA, siendo, por tanto, identificadas como metaloproteasas. El perfil I fue el más detectado tanto en los extractos celulares (79,2%) como en los extracelulares (84,4%). Las actividades de gelatinasa y elastasa medidas en el medio de cultivo fueron significativamente más elevadas (cerca de 2 veces) que en los extractos celulares y el nivel de producción varió de acuerdo al sitio del cual fue aislada la cepa. Por ejemplo, cepas aisladas de secreción traqueal produjeron cantidades elevadas de gelatinasa y elastasa medidas tanto en el extracto celular como en los extractos extracelulares. La prevalencia de los genes de elastasa reveló que el 100% de los aislamientos fueron lasB positivos y 85.42% lasA positivos. En algunos casos se observó una correlación positiva/negativa respecto a la producción de gelatinasa, elastasa, sitio de aislamiento y susceptibilidad antimicrobiana. Conclusión: La producción de proteasas fue altamente heterogénea en los aislamientos clínicos brasileños de P. aeruginosa, lo cual corroboran la versatilidad genómica/metabólica de este patógeno (AU)