Inducción de Apoptosis in vitro en hepatocitos de rata por ciclosporina A / In vitro Induction of Apoptosis by Cyclosporine A in Rat Hepatocytes

ABSTRACT

La cefalosporina A (CsA) se utiliza frecuentemente en hepatocitos de rata y fracciones mitocondriales hepáticas aisladas como inhibidor específico de la liberación de Ca2+ y como bloqueador selectivo de la permeabilidad y del potencial de membrana mitocondriales, procesos implicados en la inhibición de la apoptosis. Sin embargo, hasta ahora no se ha descrito ni la inhibición ni la inducción de apoptosis por CsA en cultivos primarios de hepatocitos de rata tras su incubación por un periodo de 4 a 20 horas. El propósito de este estudio ha sido examinar con criterios morfológicos y bioquímicos los efectos de la CsA sobre la apoptosis y esclarecer las características de los mecanismos subyacentes. Los hepatocitos de rata se cultivaron durante 4-20 horas con CsA a concentraciones de 0, 10, 25 y 50 µM. Se investigaron los fenómenos de condensación y fragmentación de la cromatina, fragmentación de ADN (TUNEL), distribución de fosfatidilcolina en la membrana (Anexina V), así como la actividad enzimática de caspasas 1, -3 y -6, el potencial de membrana mitocondrial (Rhodamina 123) y la liberación de citocromo C en el citosol. Tras cuatro horas de incubación con CsA, la condensación y fragmentación de la cromatina y el número de células TUNEL y Anexina V positivas aumentaron en función de la dosis sin que se observara pérdida enzimática, lo que indica la integridad de la membrana celular externa. Después de 20 horas de incubación con CsA, experimentaron unmayor incremento acompañado del aumento de las actividad de cistein-proteasa, caspasa-3 (CPP32) y de un ligero incremento de caspasa-6 (Mch 2), pero no de caspasa-1 (ICE). El inhibidor de caspasa-6, Ac-VEID-CHO, únicamente inhibió la apoptosis inducida por CsA. El descenso de potencial de membrana mitocondrial y la liberación de citocromo C fueron paralelos a los cambios de ultraestructuras mitocondriales y pudieran considerarse reacciones tempranas que desencadenan la cascada de fenómenos apoptóticos. La microscopía de transmisión electrónica (TEM) confirmó el incremento del número de células necróticas al cabo de 20 horas, pero no tras 4 horas de incubación, en comparación con los controles. (AU)